Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung der Kandidatengene Bcl2l15, Slc30a7, Pde5a und Ifi44 für chronisch entzündliche Darmerkrankungen im Tiermodell der Interleukin-10-defizienten Maus

Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) sind durch chronisch rezidivierende Entzündungen des Gastrointestinaltraktes gekennzeichnet. Die genaue Pathogenese der Erkrankungen konnte bis heute noch nicht im Detail geklärt werden. Allerdings ist bekannt, dass mikrobielle und umweltbedingte Faktoren in einem genetisch empfänglichen Wirt zu einer Störung der intestinalen Barriere und immunologischen Imbalancen führen. Das experimentelle Kolitismodell der Interleukin-10-defizienten (Il10-/-) Maus stellt ein geeignetes Modell zur Untersuchung von CED dar. In diesem ist der jeweilige Krankheitsverlauf abhängig vom Hintergrundstamm der Mäuse. Während Tiere des Stammes C3H/HeJBir (C3Bir) hochempfänglich für die Entwicklung einer Kolitis sind, zeigen Mäuse des Stammes C57BL/6J (B6) einen wesentlich milderen Verlauf einer Darmentzündung. Im Rahmen genetischer Kopplungsanalysen aus diesen Stämmen wurde der Cytokine deficiency induced colitis susceptibility 1 (Cdcs1)-Lokus auf dem murinen Chromosom 3 (MMU3) als Haupteinflussfaktor in der Kolitisentstehung identifiziert. In Vorarbeiten wurden innerhalb des Cdcs1-Bereichs von C3Bir die Kandidatengene Bcl2l15, Slc30a7, Pde5a und Ifi44 als wichtige Modifikatoren einer adaptiven Immunantwort vorgeschlagen. Ziel dieser Doktorarbeit war es, diese Kandidatengene zu charakterisieren und ihren Einfluss auf die Kolitisentwicklung in der Il10‑/‑ Maus und im adoptiven Transfer zu untersuchen. Entsprechend der Zielsetzung des ersten Teils dieser Dissertation wurden aus dem intra-Cdcs1-rekombinanten Stamm BC-R2 verschiedene subkongene BC-R2 Stämme mit kleineren kongenen C3Bir-Fragmenten gezüchtet (BC-R10 bis BC-R17). Diese Fragmente sollten eine reduzierte Anzahl oder im Idealfall nur noch eines der Kandidatengene Bcl2l15, Slc30a7 und Pde5a als kongenes C3Bir-Allel enthalten. Nach umfangreichen Genotypisierungen im Rahmen der Zucht mittels Mikrosatelliten wurde die genetische Authentizität dieser Stämme mittels GigaMUGA bestätigt. Anschließend wurde der Einfluss dieser Fragmente auf die spontan entstehende Kolitis im Il10-/- Modell charakterisiert. Zur Phänotypisierung wurden histologische Proben des Kolons von Tieren der Stämme B6-1, BC-R2 und BC-R10 bis BC-R17 im Alter von vier, acht, zwölf und sechzehn Wochen untersucht. Für die Charakterisierung der T-Zell-Antwort wurden Genexpressionsanalysen von Zytokinen und Transkriptionsfaktoren aus Kolongewebe sowie Multiplex-Analysen aus Kolonüberständen durchgeführt. Durch den direkten Vergleich des Phänotyps mit dem Genotyp konnten Rückschlüsse auf den Einfluss einzelner Kandidatengene auf die Kolitisentwicklung gezogen werden. Es wurde festgestellt, dass vor allem Tiere mit einem Cdcs1‑Bereich von 104,362649 Mbp bis 127,809720 Mbp mit den Kandidatengenen Slc30a7 und Pde5a eine sehr früh auftretende Form der Darmentzündung entwickelten. Immunologisch war diese durch eine hohe Expression proinflammatorischer Zytokine einer Th1-Antwort (IFNγ, TNFα) mit Th17‑Komponente (IL-17A) gekennzeichnet. Ein Cdcs1-Bereich von 88,367707 Mbp bis 104,332165 Mbp mit dem Kandidatengen Bcl2l15 konnte im Il10-/- Modell dagegen nicht mit einer vermehrten Kolitisempfänglichkeit in Verbindung gebracht werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss von Ifi44 in T-Zellen auf die Kolitisentstehung evaluiert. Dazu wurde zum einen ein adoptiver T-Zell-Transfer durchgeführt und zum anderen Ifi44 mittels CRISPR/Cas9-Technologie modifiziert. Der adoptive Transfer erfolgte mit naiven T-Zellen von B6-1 Mäusen sowie von zwei Stämmen mit unterschiedlich langen Cdcs1-Fragmenten. In letztgenannten lag Ifi44 einmal in der B6-1- (BC-R3-kurz) und einmal in der C3Bir-Variante (BC-R3-lang) vor. Die Darmentzündung wurde durch histologische Analysen des Kolons, durch Bestimmung von Zytokinen und Transkriptionsfaktoren im Kolon sowie durch Multiplex-Analysen des Serums ausgewertet. Dabei zeigten BC-R3-lang Tiere histologisch eine stärkere Entzündung des Kolons und eine höhere Expression proinflammatorischer Zytokine als Mäuse mit einem kurzen BC‑R3‑Fragment. Ferner sollte Ifi44 in T-Zellen von BC-R3-cas9 Mäusen mittels CRISPR/Cas9‑Technologie herunterreguliert werden. Dafür wurde zunächst ein Lentivirus hergestellt, der die sgRNA für Ifi44 enthielt, und anschließend die Funktionalität dieser sgRNA in vitro mittels Sequenzierung, T7-Endonuklease-I Assay und Genexpressionsanalysen verifiziert. Um den Einfluss von Ifi44 auf die Kolitisentwicklung analysieren zu können, wurde ein neues Modell etabliert, in welchem ein Knochenmarktransfer mit einem anschließenden T-Zell-Transfer kombiniert wurde. Unter Verwendung dieses Modells wurde der Einfluss von transduzierten Zellen, in welchen Ifi44 herunterreguliert war, und von unbehandelten Kontrollzellen von BC-R3-cas9 Mäusen auf die Kolitisentstehung untersucht. Die Kolitis wurde durch histologische Untersuchungen des Kolons sowie durch Genexpressionsanalysen von Zytokinen charakterisiert. Zudem wurde die Expression von Ifi44 in Knochenmarks- und T-Zellen mittels qPCR bestimmt. Innerhalb dieses Modells führte eine lentivirale Transduktion der Zellen zu einer signifikant niedrigeren Genexpression von Ifi44 ohne einen Einfluss auf die Kolitisinduktion zu haben. Zusammenfassend konnte in dieser Doktorarbeit ein Einfluss der Kandidatengene Slc30a7 und Pde5a auf die sich spontan entwickelnde Kolitis im Il10-/- Mausmodell gezeigt werden. Die Bedeutung von Bcl2l15 konnte hier nicht abschließend bewertet werden. Außerdem wurde bestätigt, dass das distale MMU3 mit dem Kandidatengen Ifi44 in T-Zellen die Kolitissuszeptibilität modifiziert. Es konnte jedoch nicht nachgewiesen werden, dass Ifi44 den Schweregrad der Kolitis deutlich beeinflusst.

Inflammatory bowel disease (IBD) is characterized by chronic relapsing inflammation of the gastrointestinal tract. Even though the pathogenesis is not fully understood yet, it is known that the genetic background interacts with microbial and environmental factors which lead to intestinal barrier disruption and immunological imbalances. A well-suited animal model for experimental IBD is the interleukin-10-deficient (Il10-/-) mouse. In this model, the colitis onset and severity are strongly influenced by the strain background. It was shown that mice on a C3H/HeJBir (C3Bir) background are highly susceptible and show an early onset of colitis, whereas mice on a C57BL/6J (B6) background are partially resistant to the development of intestinal inflammation. Quantitative trait loci analyses identified the cytokine deficiency induced colitis susceptibility1 (Cdcs1) locus on the murine chromosome 3 (MMU3) as a major modifier of colitis susceptibility. Previous studies suggested Bcl2l15, Slc30a7, Pde5a, and Ifi44 as potential candidate genes and modifiers of the adaptive immune response within the C3Bir derived Cdcs1. Therefore, in this study we aimed to investigate these candidate genes using the Il10-/- mouse model and the adoptive transfer model. In accordance with the first part of this study, various subcongenic BC-R2 strains with smaller congenic C3Bir fragments (BC-R10 to BC-R17) were generated from the intra-Cdcs1 recombinant strain BC-R2. After initial genotyping of breeders using microsatellites, their genetic authenticity was confirmed with GigaMUGA. Subsequently, the influence on the spontaneous colitis in the Il10-/- model was characterized in the newly established strains that contained a reduced number or, ideally, only one of the candidate genes Bcl2l15, Slc30a7 and Pde5a in the C3Bir derived form. For phenotyping, histological samples of the colon from animals of the strains B6-1, BC‑R2 and BC-R10 to BC-R17 were examined at the age of four, eight, twelve and sixteen weeks. To characterize the T-cell response, gene expression of cytokines and transcription factors from colon tissue was measured. In addition, Multiplex analyses of colon tissue cultures were assessed. Through a comparison of the colitis phenotype with the genotype, the influence of single candidate genes was evaluated. Especially animals carrying a C3Bir derived Cdcs1 fragment from 104.362649 Mbp to 127.809720 Mbp on MMU3 with the candidate genes Slc30a7 and Pde5a showed an early onset of intestinal inflammation. Immunologically, this was characterized by high expression of proinflammatory cytokines of a Th1 response (IFNγ, TNFα) with a Th17 component (IL-17A). In contrast, a C3Bir derived Cdcs1 fragment from 88.367707 Mbp to 104.332165 Mbp with the candidate gene Bcl2l15 could not be associated with an increased susceptibility to colitis in Il10-/- mice. The second part of this study was designed to evaluate the impact of Ifi44 in T cells on the colitis development. Firstly, an adoptive T cell transfer was performed. Secondly, Ifi44 was modified using CRISPR/Cas9 technology. Adoptive T cell transfers were performed by using naive T cells isolated from B6-1 mice and two strains with different Cdcs1 fragments. In the latter Ifi44 was once present in the B6-1 (BC-R3-short) and once in the C3Bir form (BC-R3-long). The intestinal inflammation was finally evaluated by histological analyses of the colon, by gene expression of cytokines and transcription factors in the colon and by multiplex-analyses of the serum. BC-R3-long animals histologically showed a stronger inflammation of the colon and a higher expression of proinflammatory cytokines than BC-R3-short mice. Moreover, Ifi44 was to be downregulated in T cells of BC-R3-cas9 mice using CRISPR/Cas9 technology. For this purpose, we produced a lentivirus that contained a specific sgRNA for Ifi44 and verified the functionality of this sgRNA in vitro by sequencing, by T7-endonuclease-I assay and by gene expression analyses. A new model in which a bone marrow transfer was combined with a subsequent adoptive T cell transfer was established to analyse the impact of Ifi44 on the colitis susceptibility. Using this model, the influence of transduced cells in which Ifi44 was downregulated and untreated control cells from BC-R3-cas9 mice were examined regarding their potency to induce colitis. The colitis was assessed by histological examinations of the colon and by gene expression analyses of cytokines. In addition, the expression of Ifi44 in bone marrow and T cells was determined using qPCR. Within this model, a lentiviral transduction of the cells caused a significantly lower gene expression of Ifi44 without a major influence on colitis severity. Altogether, our results demonstrated an impact of the candidate genes Slc30a7 and Pde5a on the spontaneous colitis in the Il10-/- mouse model. The role of Bcl2l15 could not be finally evaluated. In addition, it was confirmed that the distal MMU3 with the candidate gene Ifi44 modifies the colitis susceptibility of T cells. However, it could not be demonstrated that Ifi44 in particular has a major impact on colitis severity.

 

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