In vitro and in vivo development of a topical drug for the treatment of equine skin cancer – based on naturally occurring and synthetically modified substances in plane bark
Equine Sarkoide (ES) und equine maligne Melanome (EMM) gehören zu den häufigsten Hauttumoren, die bei Pferden diagnostiziert werden. Etablierte, evidenzbasierte Therapien mit anhaltender Tumorrückbildung sind selten. Die pentazyklischen Triterpene Betulinsäure (BA) und Betulin können aus vielen botanischen Quellen, vorwiegend jedoch aus der Rinde von Weißbirken und Platanen, isoliert werden. Im Rahmen des hier vorgestellten Promotionsprojektes wurden die Wirkstoffe BA, das BA-Derivat NVX-207 und das Betulinderivat Betulinyl-bis-sulfamat (BBS) auf ihr Potenzial als topisches Medikament für das ES und das EMM hin untersucht. Alle in vier Manuskripten beschriebenen in vitro und in vivo Studien haben das übergeordnete Ziel, zu der Entwicklung eines topischen Arzneimittels für die Behandlung von Hautkrebs bei Pferden beizutragen. Es konnte gezeigt werden, dass die Substanzen BA, NVX-207 und BBS in vitro signifikante antiproliferative und zytotoxische Wirkungen gegenüber ES Zellen, EMM Zellen und equinen dermalen Fibroblasten haben. Der aktive Wirkmechanismus war die Apoptose. Die Wirkstoffe zeigten eine gute Penetration und Permeation durch die Epidermis und Dermis isolierter Pferdehaut und die mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie nachgewiesenen Mengen an BA und NVX-207 überstiegen bei weitem die zuvor berechneten mittleren inhibitorischen Konzentrationen für ES und EMM Zellen. Diese Ergebnisse wurden durch in vivo Permeationsstudien an acht gesunden Pferden bestätigt. Im Rahmen dieser Studien wurde zudem die lokale und systemische Verträglichkeit der topisch applizierten Wirkstoffe nachgewiesen. Schließlich zeigte die randomisierte, placebokontrollierte, doppelt verblindete in vivo Wirksamkeitsstudie die hohe Praktikabilität und gute Verträglichkeit der topischen Anwendung von 1 % BA bzw. 1 % NVX-207 zweimal täglich über dreizehn aufeinanderfolgende Wochen bei EMM Patienten im Frühstadium. Obwohl mit den untersuchten pharmazeutischen Formulierungen keine vollständige Remission der Tumore erreicht werden konnte, wurde ein deutliches Ansprechen der Neoplasien auf die Behandlung mit BA und NVX-207 beobachtet. Angesichts der pro Testsubstanz auf jeweils sechs Pferde begrenzten Gruppengrößen sind die Ergebnisse der Wirksamkeitsstudie jedoch als vorläufig zu betrachten und müssen anhand einer größeren Patientenkohorte verifiziert werden. Modifikationen in den pharmazeutischen Formulierungen könnten zudem das klinische Ergebnis weiter verbessern. Insgesamt sind die generierten Ergebnisse des vorliegenden Promotionsprojektes vielversprechend und unterstützen prospektive in vitro und in vivo Untersuchungen mit BA, NVX-207 und BBS, welche die Entwicklung einer topischen Therapie für die Behandlung von ES und EMM zum Ziel haben.
Equine sarcoids (ES) and equine malignant melanoma (EMM) are among the skin tumors affecting horses diagnosed most frequently. The treatment of equine skin cancer can be challenging and established, evidence-based therapies resulting in sustained tumor regression are rare. The pentacyclic triterpenes betulinic acid (BA) and betulin can be isolated from many botanical sources, predominantly from the bark of white birch and plane trees. Within the framework of the current PhD project, the compounds BA, BA derivative NVX-207, and betulin derivative betulinyl-bis-sulfamate (BBS) were assessed for their potential as an epicutaneous therapy for ES and EMM. Various in vitro and in vivo studies are described in four manuscripts, all with the overall purpose of contributing to the development of a topical drug for the treatment of equine skin cancer. The substances were demonstrated to exert significant antiproliferative and cytotoxic effects against ES cells, EMM cells, and equine dermal fibroblasts in vitro. The active mode of action was apoptosis. The compounds penetrated and permeated the epidermis and dermis of isolated equine skin and the amounts of BA and NVX-207 detected by high-performance liquid chromatography exceeded by far the previously determined half-maximal inhibitory concentrations of ES and EMM cells. These results were confirmed by in vivo permeation studies in eight healthy horses. In the context of these studies, the local and systemic safety of the BA and NVX-207 applied topically were proven. Finally, the topical application of 1 % BA or 1 % NVX-207 twice a day for 13 consecutive weeks in early stage EMM patients proved to be convenient and safe, as shown by the randomized, placebo-controlled, double-blind in vivo efficacy study. Even though no complete remission of the tumors could be achieved with the test formulations investigated, a clear tumor response was observed after treatment with both BA and NVX-207. However, the findings of the efficacy study must be regarded as preliminary due to the limited group size (six horses each) and need to be verified in a larger cohort. Modifications of the pharmaceutical formulations may further improve the clinical outcome. In conclusion, the results generated are promising and support prospective investigations of BA, NVX-207 and BBS in both in vitro and in vivo models aiming at developing a topical therapy for the treatment of ES and EMM.
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