Development of an in vitro model for studying physiological properties and pathogenicity mechanisms of gut diseases caused by zoonotic pathogens

Infektiöse Krankheiten des Gastrointestinaltraktes treten regelmäßig in Menschen und Tieren auf. Oft werden diese Infektionen durch Bakterien verursacht, die über kontaminiertes Wasser oder Nahrung aufgenommen werden. Im Falle von Zoonosen kann die Übertragung von infektiösem Material von Tieren auf den Menschen und umgekehrt erfolgen. Jedoch entwickeln nicht alle infizierten Spezies klinische Symptome, was auf Unterschiede der molekularen Pathogenitätsmechanismen hinweist, welche in vielen Fällen noch nicht ganz verstanden sind. Ein Beispiel hierfür sind Schweine, die eine Vielzahl von Zoonoserregern in sich tragen, die beim Menschen zu schweren Krankheitsverläufen führen, im Schwein jedoch eine asymptomatische Infektion vorliegt. Um diese Speziesunterschiede aufzudecken sind spezies-spezifische Modelle des Gastrointestinaltraktes notwendig. Momentan werden solche Tierversuche mit Labortieren durchgeführt, jedoch wird eine Reduzierung von Tierversuchen bereits gesetzlich durch die Richtlinie 2010/63/EU vorgeschrieben wird. Aus diesem Grund ist das Ziel der vorliegenden PhD-These ein in vitro Modell zu entwickeln um die Zahl der Versuchstiere zu reduzieren und gleichzeitig die Pathogenitätsmechanismen von Darmerkrankungen, verursacht durch Zoonoseerreger, zu untersuchen. Im Fokus des Projektes lagen hierbei die Enterotoxine von Vibrio cholerae und Escherichia coli und deren Wirkung auf porzines und humanes Darmepithel. Im ersten Teil des PhD-Projektes wurde der Einfluss von nativem Darminhalt aus dem Colon auf das Colonepithel in der Ussingkammer untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine Verminderung der physiologischen Transportkapazität des Epithels. Zudem wiesen histologische Untersuchungen wiesen auf eine Degradierung und Autolyse des Gewebes hin. Aus diesem Grund wurde geschlussfolgert, dass dieser Versuchsaufbau nicht geeignet war um Fragestellungen bezüglich gastrointestinaler Infektionen und zugrundeliegende Mechanismen mit der Ussingkammer zu untersuchen. Um den erwähnten Gewebeabbau und die Autolyse zu umgehen und sich der menschlichen Physiologie anzunähern, wurde ein etabliertes Co-Kultursystem, bestehend aus enterozytenähnlichen Caco-2-Zellen und becherzellähnlichen HT29-MTX-Zellen, eingesetzt. Die Charakterisierung der physiologischen Eigenschaften und pathophysiologischen Reaktionen des Epithels wurde im zweiten Teil des PhD-Projektes durchgeführt. Untersuchungen zu epithelialen Funktionen der co-kultivierten Zellen in der Ussingkammer zeigte deren Fähigkeit zur transepithelialen Glukoseaufnahme und Chloridsekretion. Darüber hinaus zeigten Proteinexpressionsmuster weitere physiologische Eigenschaften des Dünndarmepithels, wie die Expression von Glukose- und Peptidtransportern. Die histologische Analyse zeigte das Vorhandensein einer Schleimschicht, die das darunterliegende Epithel bedeckt sowie die Expression von tight junction-assoziierten Proteinen. Wurden die Co-Kulturen Toxinen von V. cholerae und E. coli ausgesetzt, konnte eine erhöhte Chloridsekretion nachgewiesen werden, die mit der in vivo Situation während einer Infektion mit diesen Erregern vergleichbar war. Zusammenfassend zeigte dieses Co-Kultur-Modell physiologische Transporteigenschaften des menschlichen Dünndarms und ähnliche Reaktionen auf bakterielle Toxin, wie es für die in vivo Situation beschrieben ist. Dies zeigt die Eignung dieses Modells zur Untersuchung von (patho)physiologischen Eigenschaften des menschlichen Dünndarms. Damit steht ein tierfreies Modell zur Verfügung ohne das ethische Probleme der Bereitstellung von menschlichem Material auftreten. Im dritten Teil dieses Projektes wurde ein porzines Organoid-system, generiert aus Krypten des porzinen Jejunums und Colons, etabliert und untersucht. Die Analyse der Genexpression zeigte eine hohe Vergleichbarkeit zwischen den Organoiden und dem jeweiligen Darmsegment. Darüber hinaus bildeten die Organoide in 2D-Kultur eine Monolayer-Struktur mit schleimproduzierenden Zellen und Expression von interzellulären tight junction-assoziierten Proteinen. Die Inkubation von 2D-Jejunum-Organoiden in Ussingkammern zeigte Glukoseabsorption- und Chlorid-Sekretionseigenschaften, die mit denen des nativen Jejunumepithels vergleichbar sind. Obwohl porzine Infektionen mit V. cholerae asymptomatisch sind, wurde die Inkubation mit Cholera-Toxin als proof of principle durchgeführt und führte zu einer erhöhten Chloridsekretion, vergleichbar mit der in vivo Situation und dem humanen Co-Kultur-System. Das organoid-basierte Modell des Schweinecolons bedarf einer weiteren Validierung in Ussingkammerexperimenten, zeigte aber durch Messungen der darmspezifischen Genexpression eine hohe Vergleichbarkeit zum nativen Colongewebe. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Schweineorganoide des Darms ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung speziesspezifischer (patho)physiologischer Fragestellungen im Zusammenhang mit intestinalen Epithelfunktionen darstellen. Dabei können porzine Organoide des Jejunums und Colons eingesetzt werden, um sich auf Themen wie potenziell zoonotische Infektionen des Schweinedarms zu konzentrieren.