Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

C-type lectin receptor recognition in parasitic infections

Myeloid C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) recognising carbohydrate structures of all classes of pathogens, including bacteria, virus, fungi and parasites, thereby initiating innate as well as shaping adaptive immunity to intruding agents. Parasitic protozoans and helminths are known to modulate the host immune response by the secretion of immunomodulatory factors, including a vast number of proteins, lipids, and other molecules, most of which are heavily glycosylated. Although these glycosylated immunomodulatory factors represent promising ligands for CLRs, almost nothing is known about the contribution of CLRs to parasite infections. Therefore, the first part of this work aimed to unravel yet unknown interactions of CLRs with the protozoan parasites of the genus Plasmodium, and the helminths Toxocara canis and Toxocara cati. Plasmodium spp. remain one of the major global causes of death from infectious diseases. Morbidity is mainly due to cerebral malaria (CM), as severe neurological disorders are common symptoms of CM. A contribution of the CLR dendritic cell immunoreceptor (DCIR) to CM has previously been shown, whereas the role of other CLRs has not been unravelled so far. Using a murine CLR-hFc fusion protein library, we identified CLEC12A as a novel receptor for plasmodial hemozoin, a parasite-derived crystalline disposal product. Hemozoin affected dendritic cell (DC) effector function with significantly reduced reactive oxygen species (ROS) production in CLEC12A-/- DCs compared to wild-type DCs. DC/T cell co-culture assays indicated that the CLEC12A/hemozoin interaction enhanced CD8+ T cell cross-priming since hemozoin-induced granzyme B and IL-2 secretion was CLEC12A-dependent. The dog roundworm Toxocara canis and the cat roundworm Toxocara cati are worldwide distributed zoonotic intestinal helminths with frequent exposure to humans. Within paratenic hosts’ tissue, Toxocara third-stage larvae (L3) can persist up to a decade due to immune evasion and cause severe disease pathology such as visceral as well as ocular larva migrans and neurotoxocarosis. Immune responses to Toxocara infection are mainly mediated by L3-secreted Toxocara excretory-secretory antigens (TES), which are the key drivers of Toxocara-mediated immune evasion and contain a vast number of glycoconjugates as potential targets for CLRs. To date, little is known about the role of CLRs during toxocarosis. The use of the CLR-hFc fusion protein library in ELISA-based assays revealed two promising candidate CLRs, macrophage galactose-type lectin-1 (MGL-1) and macrophage C-type lectin (MCL), recognising T. canis and T. cati-derived antigens. MGL-1 bound to the oral aperture of both T. canis and T. cati L3 in immunofluorescence microscopy. Immunoblot defined distinct protein fractions of TES and Toxocara somatic antigens (TSOM) interacting with MGL-1 and MCL, thus containing potential ligands for these CLRs. Moreover, stimulating MCL-/- DCs with Toxocara spp. antigen showed that T. cati-mediated IL-6 and TNF cytokine production of DCs was MCL-dependent suggesting an immunological relevance of the MCL/T. cati interaction. The work presented in this thesis provides novel insights into the CLR-mediated immune response against Plasmodium and Toxocara spp., holding potential for urgently needed novel applications in therapy and diagnosis of malaria and toxocarosis. Most of all, the availability of reliable, sensitive, and specific serological tests detecting human Toxocara exposure is limited. To meet this need, the second part of the thesis involved the establishment of a commercially available anti-Toxocara ELISA and WB, which were recently brought to market. Sensitivity and specificity of both ELISA and WB exceeded 90% compared to an over 20 years established in-house anti-Toxocara ELISA; thus, these newly developed tests are suitable to be used in routine diagnosis and seroepidemiological studies on toxocarosis. In conclusion, the presented work revealed novel CLR/parasite interactions, unravelling CLEC12A as an innate sensor for plasmodial hemozoin and MGL-1 and MCL as promising candidates for immunomodulation during toxocarosis, and proved two commercially available serological tests as highly reliable for detection of Toxocara infection, ultimately giving the prospect for their use in Toxocara diagnosis.

Myeloide C-Typ Lektin-Rezeptoren (CLRs) gehören zur Gruppe der Mustererkennungsrezeptoren (pattern recognition receptors, PRRs) und erkennen vorwiegend Kohlenhydratstrukturen aller Erregerklassen wie Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten. Diese Erkennung hat die Einleitung der angeborenen Immunität und nachfolgend die Modulierung der adaptiven Immunität zur Folge. Parasitische Protozoen und Helminthen sind dafür bekannt, die Immunantwort des Wirtes mit Hilfe von sekretierten immunmodulatorischen Faktoren zu beeinflussen. Diese Faktoren setzen sich aus unterschiedlichsten Proteinen, Lipiden und anderen Molekülen zusammen und sind zumeist stark glykosyliert. Trotz der Tatsache, dass diese glykosylierten immunmodulatorischen Faktoren vielversprechende Liganden für CLRs darstellen, ist bisher nur wenig bezüglich der Beteiligung von CLRs bei parasitären Infektionen bekannt. Daher war es das Ziel des ersten Teils dieser Arbeit, bisher unbekannte Interaktionen von CLRs mit protozoären Erregern der Gattung Plasmodium sowie den Helminthen Toxocara canis und Toxocara cati zu identifizieren und zu charakterisieren. Protozoen der Gattung Plasmodium sind Erreger der Malaria und verursachen nach wie vor eine Vielzahl der durch Infektionskrankheiten bedingten Todesfälle. Die Mortalität ist hauptsächlich durch die zerebrale Malaria (ZM) bedingt, da diese häufig in schweren neurologischen Störungen resultiert. Eine Beteiligung des CLR dendritischer Zell-Immunrezeptor (dendritic cell immunoreceptor, DCIR) in der ZM wurde bereits gezeigt. Über die Rolle weiterer CLRs ist bisher jedoch wenig bekannt. Mit Hilfe einer murinen CLR-hFc Fusionsprotein-Bibliothek wurde Hämozoin, ein von Plasmodien produziertes kristallines Stoffwechselprodukt, als distinkter Ligand von CLEC12A nachgewiesen. Hämozoin beeinflusste die Effektorfunktion dendritischer Zellen (DZs) mit einer verminderten reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) -Produktion von CLEC12A-/- DZs. DZ/T‑Zell-Kokultivierungen zeigten, dass die CLEC12A/Hämozoin Interaktion zur Kreuzpräsentation von CD8+ T-Zellen beiträgt, die infolgedessen Granzym B und IL-2 vermehrt sezernieren. Der Hundespulwurm Toxocara canis und der Katzenspulwurm Toxocara cati sind weltweit verbreitete intestinale Helminthen mit zoonotischer Bedeutung. Durch Immunevasion können Toxocara-Larven (L3) oft jahrelang im Gewebe von paratenischen Wirten persistieren, was mit klinischen Symptomen (viszerale, okuläre oder Neurotoxokarose) einhergehen kann. Das von Larven sezernierte exkretorisch-sekretorische Antigen (TES), das als Auslöser für die Immunantwort gegen und als Mediator der Immunevasion von Toxocara gilt, besteht aus einer Vielzahl von Glykokonjugaten, die potenziell von CLRs erkannt werden. Ungeachtet dessen ist bisher nur wenig über die Rolle von CLRs bei der Toxokarose bekannt. Das Makrophagen Galaktose-Typ Lektin (MGL-1) und das Makrophagen C-Typ Lektin (MCL) wurden mittels ELISA-basierten Bindungsstudien als vielversprechendste Rezeptor-Kandidaten, sowohl für die Bindung an T. canis- als auch T. cati-Antigen, identifiziert. Die Immunfluoreszenzmikroskopie infektiöser T. canis- und T. cati-L3 zeigte, dass MGL-1 an die Mundöffnung beider Parasiten bindet. Mittels Immunoblot konnten TES- und Toxocara somatisches Antigen (TSOM)-Proteingruppen identifiziert werden, die potenzielle CLR-Liganden für MGL-1 und MCL beinhalteten. Die immunologische Relevanz der MCL/T. cati-Interaktion wurde anhand von DZ-Stimulationsassays gezeigt, in denen die IL-6- und TNF-Zytokinsekretion T. cati-stimulierter DZs MCL-abhängig war. Die in der Arbeit gewonnen Erkenntnisse ermöglichen neue Einblicke in die CLR-vermittelte Immunantwort gegen Plasmodium und Toxocara spp. und zeigen möglicherweise Perspektiven für dringend benötigte, neuartige Anwendungsmöglichkeiten in der Therapie und Diagnose der Malaria und Toxokarose auf. Insbesondere die Diagnostik der Toxokarose gestaltet sich als schwierig, da es derzeit an zugänglichen und zuverlässigen serologischen Tests mit einer hohen Sensitivität und Spezifität mangelt. Um diesem Defizit entgegenzuwirken, beinhaltete der zweite Teil dieser Arbeit die Etablierung eines neuen, kommerziell erhältlichen ELISAs und Westernblots. Beide neu entwickelten serologischen Nachweismethoden zeigten Sensitivitäten und Spezifitäten von über 90% im Vergleich zu einem über 20 Jahre etablierten in-house ELISA, und stellen somit geeignete Tests für die Anwendung im Bereich der Routinediagnostik und seroepidemiologischer Studien zum Nachweis der Toxokarose dar. Somit wurden in der hier präsentierten Arbeit neue CLR/Parasiten-Interaktionen aufgedeckt, mit Hämozoin als distinkten Liganden für CLEC12A und MGL-1 und MCL als vielversprechende Kandidaten hinsichtlich der Immunmodulation bei der Toxokarose. Zudem wurden zwei kommerziell erhältliche serologische Tests zur Detektion einer Toxocara-Infektion als sehr zuverlässig evaluiert und schlussendlich Perspektiven für die Nutzung von CLRs im Rahmen der Toxocara-Diagnose aufgeführt.

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