Evaluation of Bumetanide Derivatives in a Rat Model of Neonatal Seizures
Seizures are the most frequent type of neurological emergencies in newborn infants during the first 28 days of life. Phenobarbital (PB) is currently the most widely used anticonvulsant drug for the treatment of neonatal seizures, but it fails to stop them in ~50% of cases. In a preclinical trial, bumetanide, an inhibitor of the Na-K-2Cl cotransporter NKCC1, showed positive effects in a hypoxia model of neonatal seizures whereas it was ineffective in a human trial. Bumetanide penetrates poorly into the brain, so we focus on the bumetanide derivatives DIMAEB and bumepamine, which penetrate the blood-brain barrier more easily due to higher lipophilicity and lower ionization rate. In this study, a novel asphyxia model in neonatal rats was used, which was designed for better translatability to the human situation. The aim of this study was to determine the reproducibility of the previous preclinical bumetanide data, to verify the therapeutic predictive value of the novel model using commonly used anticonvulsants, and to investigate the anticonvulsant effect of novel bumetanide derivatives as an add-on to PB for the treatment of neonatal seizures.
In 11-day old rats, intermittent asphyxia was induced by an increase in CO2 (20%) with stepwise changes in O2 (5-9%) applied for 30 min. After asphyxia, animals were re-exposed to room air. In a first study, animals were treated with PB (15 mg/kg) 30 min before asphyxia and/or bumetanide (0.3 mg/kg) 15 min before asphyxia. In a second study, bumetanide (0.3 mg/kg) and PB (30 mg/kg) were administered directly after asphyxia. In an additional trial, we applied bumetanide (10 mg/kg) or bumetanide derivatives (equimolar dose) 15 min and PB (15 mg/kg) directly before asphyxia. PB alone (15 or 30 mg/kg) was administered 15 min before or directly after asphyxia. Midazolam (1 mg/kg) was administered directly before or after asphyxia. For histological analysis, animals were perfused 24h after asphyxia. We assessed increased cell proliferation and differentiation and neuronal injury at 24h post-asphyxia using c-Fos, NeuN, and caspase-3 immunoreactivity.
All untreated animals developed seizures within 10 minutes after the end of asphyxia. In histological analysis, a significant decrease in neuronal density was shown in the CA1 region of the hippocampus. Moreover in animals with the severest seizures (stage V), caspase-3 immunolabeling indicated neuronal apoptosis. Treatment with 30 mg/kg PB before or 1 mg/kg midazolam before and after asphyxia caused a decrease in seizure occurrence as well
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as the treatment with bumetanide derivatives in combination with PB (15 mg/kg) whereas the combination of bumetanide and PB did not.
These data show that the novel asphyxia model for neonatal seizures has an increased face and content validity, and therefore displays an enhanced translational value compared to traditional models of birth asphyxia. The novel bumetanide derivatives DIMAEB and bumepamine as add on to PB are promising compounds for further investigation in the field of neonatal seizure treatment.
Neonatale Anfälle sind die häufigste Art neurologischer Notfälle bei Neugeborenen in den ersten 28 Lebenstagen. Phenobarbital (PB) ist derzeit das am häufigsten verbreitete Antikonvulsivum zur Behandlung von Krampfanfällen bei Neugeborenen, kann diese jedoch in ~50% der Fälle nicht beenden. In einer präklinischen Studie zeigte Bumetanid, ein Inhibitor des Na-K-2Cl-Co-Transporters NKCC1, in einem Hypoxie-Modell neonataler Krampfanfälle positive Wirkungen, während es in einer Studie am Menschen unwirksam war. Bumetanid penetriert schlecht in das Gehirn, daher konzentrieren wir uns auf die Bumetanidderivate DIMAEB und Bumepamin, die die Blut-Hirn-Schranke aufgrund ihrer höheren Lipophilie und ihrer niedrigeren Ionisierungsrate leichter durchdringen. Ziel dieser Studie war esanhand eines neuartigen Asphyxiemodells in neonatalen Ratten, welches für eine bessere Übertragung auf die menschliche Situation konzipiert wurde, die Reproduzierbarkeit der Daten des Modells festzustellen, die therapeutische Vorhersagekraft des Modells mittels üblicherweise genutzten Antikonvulsiva zu überprüfen und die antikonvulsive Wirkung von neuartigen Bumetanidderivaten als add-on zu PB zu untersuchen.
Bei 11 Tage alten Ratten wurde eine intermittierende Asphyxie durch eine Erhöhung des CO2-Gehalts (20%) induziert, wobei 30 Minuten lang schrittweise Veränderungen des O2-Gehalts (5-9%) appliziert wurden. Nach der Asphyxie wurden die Tiere erneut der Raumluft ausgesetzt. Zur histologischen Analyse wurden die Tiere 24 Stunden nach der Asphyxie perfundiert. Hierbei wurden vermehrte Cellproliferation und –differenzierung sowie Neurodegeneration unter Verwendung der c-Fos-, NeuN- und Caspase-3-Immunreaktivität untersucht. In einer ersten Studie wurden PB (15 mg/kg) 30 min vor und/oder Bumetanid (0.3 mg/kg) 15 min vor Asphyxie verabreicht. In einem zweiten Versuch wurden Bumetanid (0.3 mg/kg) und PB (30 mg/kg) direkt nach der Asphyxie verabreicht. In einem zusätzlichen Versuch verabreichten wir Bumetanid (10 mg/kg) oder Bumetanidderivate (äquimolare Dosis) 15 min vor und PB (15 mg/kg) direkt vor der Asphyxie. PB (15 oder 30 mg/kg) alleine wurde 15 min vor oder direkt nach der Asphyxie verabreicht. Midazolam (1 mg/kg) wurde direkt vor oder nach der Asphyxie verabreicht.
Alle unbehandelten Tiere entwickelten innerhalb von 10 Minuten nach dem Ende der Asphyxie Krampfanfälle. In der histologischen Analyse zeigte sich eine signifikante Abnahme der neuronalen Dichte in der CA1-Region des Hippocampus. Darüber hinaus zeigte die
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Caspase-3-Immunmarkierung bei Tieren mit den schwersten Anfällen (Stadium V) vermehre Apoptose der Neuronen an. Die Behandlung mit 30 mg/kg PB vor oder 1 mg/kg Midazolam vor und nach der Asphyxie führte zu einer Abnahme der Anfallshäufigkeit. Die Behandlung mit Bumetanidderivaten in Kombination mit PB (15 mg/kg) potenzierte die Wirkung von PB, während die Kombination von Bumetanid und PB dies nicht tat.
Diese Daten zeigen, dass das Asphyxiemodell für Neugeborenenanfälle eine erhöhte therapeutische Validität hat und daher im Vergleich zu traditionellen Modellen der Geburtsasphyxie einen erhöhten Translationswert aufweist. Die neuen Bumetanidderivate DIMAEB und Bumepamin als add-on zu PB sind vielversprechende Substanzen für weitere Untersuchungen auf dem Gebiet der Behandlung von Neugeborenenanfällen.
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