Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Dry storage of bodily fluids for disease diagnostics and genome resource banking

The central aim of this thesis was to study different strategies for the dry preservation and long term storage of different bodily fluids, investigating the macromolecular stability in the dried state for diagnostic applications in reproductive and regenerative medicine.
In chapter 2, the beneficial effect of using sugars as lyoprotectants before freeze-drying human plasma was investigated. Differential scanning calorimetry (DSC) was used to study the glass transition temperature of freeze-dried plasma samples with(out) protectants. It was shown that samples dried with trehalose exhibit the highest glass transition temperature (~ 72°C) followed by sucrose (~ 46°C) and glucose (~ 15°C). In addition, it was found that those sugars appear to be equally effective in preventing protein aggregation of freeze-dried plasma samples in a dose-dependent manner. It was shown that protein aggregation by means of turbidity was prevented also in case of pure/monoclonal IgG (i.e. model study) by adding 10% sugars concentration. Infrared (IR) spectroscopy was employed to analyze the overall protein secondary structure of plasma samples freeze-dried with(out) different sugars. Inspection of the protein amide-I band in FTIR spectra of freeze-dried plasma samples reveals that plasma proteins form an extended β-sheet structures during drying without protectants, whereas in presence of sugars the relative proportion of α-helical structures is clearly greater. In agreement, the (un)supervised machine learning approach Principal Component Analysis (PCA) conducted on the amide-I region, revealed that freeze-dried plasma with sugars exhibit more compact score plots. This indicates that samples are more stable and homogeneous when freeze-drying is done in presence of sugars. For investigating storage stability, freeze-dried plasma samples were stored for different durations at different temperatures. To obtain more detailed insights in kinetics of protein aggregation, a broad range of temperatures and storage durations was tested. It was found that trehalose reduces protein aggregation during long term storage for temperatures ranging from 4°C to 60°C. In fact, when trehalose was added, there was only a minor increase in turbidity with increasing temperature. However, total IgG content of hydrated and freeze-dried samples (i.e. stored for 30 d at ambient temperature) were similar as those determined for samples stored frozen at −80°C, and no differences were seen for specimens with(out) trehalose. Accumulation of reactive oxygen species (ROS) during storage of hydrated and dried plasma samples was analyzed using nitroblue tetrazolium (NBT) and protein carbonyl content. It is shown that trehalose reduces the accumulation of ROS (i.e. oxidative damage) during storage under different conditions. In summary, such data show the beneficial effect of adding sugars (i.e. trehalose) before freeze-drying human plasma.
In chapter 3, the spectral fingerprinting of human saliva dried on filters was studied. Saliva from different donors was collected via spitting or using swabs and analyzed microscopically. Higher cell numbers and DNA amounts were recovered for spitting as compared to using swabs. Thus, saliva collected via ordinary spitting was therefore used for further studies. It was demonstrated that saliva dried onto PVDF filters in the presence of a stream of dry air was faster when compared with others approaches. Parameters characterizing storage stability, such as temperature and relative humidity were investigated via evaluating the DNA content extracted from saliva samples stored under different conditions. Storage at high relative humidity conditions ( i.e. 75 or 95% RH) showed low amount of DNA recovered, indicating degradation took place. This was also observed after long term storage (90 days) for samples stored under ambient conditions (~ 22 °C, ~ 50% RH) without protective measures. In fact, it can be seen that saliva dried without a lyoprotectant exhibits a higher relative content of extended β-sheet structures compared to samples that were dried in the presence of sugars, i.e. the band intensity ratio [I(β-sheet)/I(α-helix] is reduced when saliva is dried in the presence of sucrose. This implies that sugars prevent dehydration induced protein aggregation. FTIR analysis was also used to study characteristic bands arising from the DNA backbone in the fingerprint region. In order to reveal differences among treatment groups that are difficult to observe in the complex fingerprint region of the FTIR spectra, vector normalized spectra obtained from samples stored for different periods (up to 90 days) at different conditions, such as relative humidities and temperatures were analyzed with Principal Component Analysis (PCA). Samples are mostly separated on PC1, which describes approximately 60% of the observed variance and allows a clear discrimination between trends and patterns among treated groups (with or without sucrose) as well as different storage time. PCA analysis shows that saliva dried on filters in the presence of sucrose exhibit, during storage, higher stability both under normal (%R.H.<75 or 4°C) and accelerated aging conditions (%R.H.>75% or 37°C), thus demonstrating great power of FT-IR spectroscopy combined with PCA in the early screening of dried bio specimens. It is concluded that dry biobanking of saliva by air-drying on filters can be used for storage and transport of samples for genetic field studies.
In chapter 4, characteristics of sperm DNA were investigated, for sperm samples dried using different protective formulations. Evaluation of different drying temperatures have shown that sperm dried in presence of lyoprotectants exhibits a stable viscous glassy state, where biomolecules are immobilized and damaging reactions are slowed down. In contrast, crystal formation was evident for samples not supplemented with sugars and/or albumin. In order to assess drying-induced ROS formation and DNA fragmentation during storage, NBT and SCSA assays were performed for samples with(out) sugars and/or albumin. It was found that in presence of protectants sperm damage was prevented, both in terms of ROS accumulation and DNA fragmentation. To assess the overall sperm DNA structure, before and after drying, FT-IR was performed. Drying induced B to A-like DNA transitions were evident as prominent peak changes in the fingerprint region, and specific for the hydrated (B-like structure) or dried (A-like structure) form. Upon drying, the reversibility to re-hydrated form was monitored for pure dsDNA as well sperm DNA, which showed a similar trend in terms of absorbance peaks. Use of trehalose and albumin prior to drying was found to be efficient during storage at different temperatures, where score plots obtained with PCA appear more homogenous and stable (i.e. more compact dots) when compared with samples without protectants. This indicates that drying of sperm in presence of trehalose and albumin is effective in preventing sperm DNA structure damages.



Das Hauptziel dieser Arbeit war es, verschiedene Strategien zur Trockenkonservierung und Langzeitlagerung verschiedener Körperflüssigkeiten zu untersuchen und die makromolekulare Stabilität im getrockneten Zustand für diagnostische Anwendungen in der reproduktiven und regenerativen Medizin zu untersuchen.
In Kapitel 2 wurde die vorteilhafte Wirkung der Verwendung von Zuckern als Lyoprotektiva vor der Gefriertrocknung von menschlichem Plasma untersucht Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) wurde verwendet, um die Glasübergangstemperatur von gefriergetrockneten Plasmaproben mit (oder Ohne) Schutzmitteln zu untersuchen. Es wurde gezeigt, dass mit Trehalose getrocknete Proben die höchste Glasübergangstemperatur (~ 72°C) aufweisen, gefolgt von Saccharose (~ 46°C) und Glucose (~ 15°C). Zusätzlich wurde es gefunden, dass diese Zucker gleichermaßen wirksam sind, um die Proteinaggregation von gefriergetrockneten Plasmaproben in dosisabhängiger Weise zu verhindern. Es wurde gezeigt, dass die Proteinaggregation auch im Fall von reinem / monoklonalem IgG (d. h. Modellstudie) durch Zugabe von 10% Zuckerkonzentration verhindert wurde. Infrarot (IR) -Spektroskopie wurde verwendet, um die gesamte Proteinsekundärstruktur von Plasmaproben zu analysieren, die mit (oder Ohne) verschiedenen Zuckern gefriergetrocknet wurden. Die Untersuchung der Proteinamid-I-Bande in FTIR-Spektren gefriergetrockneter Plasmaproben zeigt, dass Plasmaproteine während der Trockung ohne Schutzmittel ausgedehnte β-Faltblattstrukturen bilden, während in Gegenwart von Zuckern der relative Anteil an α-helikalen Strukturen deutlich größer ist. In Übereinstimmung damit ergab der Principal Component Analysis (PCA), der an der Amid-I-Region durchgeführt wurde, dass gefriergetrocknetes Plasma mit Zuckern kompaktere Score-Plots aufweist. Dies zeigt an, dass die Proben stabiler und homogener sind, wenn die Gefriertrocknung in Gegenwart von Zuckern durchgeführt wird. Zur Untersuchung der Lagerstabilität wurden gefriergetrocknete Plasmaproben für unterschiedliche Zeiträume bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert. Um detailliertere Einblicke in die Kinetik der Proteinaggregation zu erhalten, wurde ein breiter Bereich von Temperaturen und Lagerungszeiten getestet. Es wurde gefunden, dass Trehalose die Proteinaggregation während der Langzeitlagerung bei Temperaturen von 4° C auf 60°C reduziert. Tatsächlich gab es bei Zugabe von Trehalose mit zunehmender Temperatur nur einen geringen Anstieg der Trübung. Der Gesamt-IgG-Gehalt von hydratisierten und gefriergetrockneten Proben (d. h. 30 Tage bei Umgebungstemperatur gelagert) war jedoch ähnlich wie der für Proben, die bei –80°C gefroren gelagert wurden, und es wurden keine Unterschiede für Proben mit ( oder ohne) Trehalose festgestellt. Die Akkumulation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) während der Lagerung von hydratisierten und getrockneten Plasmaproben wurde unter Verwendung von Nitroblau-Tetrazolium (NBT) und Proteincarbonylgehalt analysiert. Es wurde gezeigt, dass Trehalose die Anreicherung von ROS (d. h. oxidative Schädigung) während der Lagerung unter verschiedenen Bedingungen verringert. Zusammenfassend zeigen solche Daten die vorteilhafte Wirkung der Zugabe von Zucker (d. H. Trehalose) vor der Gefriertrockung von menschlichem Plasma.
In Kapitel 3 wurde der spektrale Fingerabdruck von auf Filtern getrocknetem menschlichem Speichel untersucht. Der Speichel von verschiedenen Spendern wurde durch Spucken oder unter Verwendung von Tupfern gesammelt und mikroskopisch analysiert. Im Vergleich zur Verwendung von Tupfern wurden höhere Zellzahlen und DNA-Mengen durch Spucken erhalten. Daher wurde der Speichel, der durch gewöhnliches Spucken gesammelt wurde, für weitere Studien verwendet. Es wurde gezeigt, dass der Speichel, der in Gegenwart eines trockenen Luftstroms auf PVDF-Filter getrocknet wurde, im Vergleich zu anderen Ansätzen schneller war. Parameter, die die Lagerstabilität charakterisieren, wie Temperatur und relative Luftfeuchtigkeit, wurden untersucht, indem der DNA-Inhalt bewertet wurde, der aus Speichelproben extrahiert wurde, welche unter verschiedenen Bedingungen gelagert wurden. Die Lagerung bei Bedingungen mit hoher relativer Luftfeuchtigkeit (d. h. 75 oder 95% relative Luftfeuchtigkeit) hat eine geringe Menge an erhaltener DNA gezeigt, was darauf hinweist, dass ein Abbau stattgefunden hat. Dies wurde auch nach Langzeitlagerung (90 Tage) bei Proben beobachtet, die unter Umgebungsbedingungen (~ 22 ° C, ~ 50% rF) ohne Schutzmaßnahmen gelagert wurden. Tatsächlich ist es ersichtlich, dass Speichel, der ohne Lyoprotektivum getrocknet wurde, einen höheren relativen Inhalt an ausgedehnten β-Faltblattstrukturen aufweist als Proben, die in Gegenwart von Zuckern getrocknet wurden, was bedeutet, dass das Bandenintensitätsverhältnis [I (β-Faltblatt) / I. (α-Helix] reduziert wird, wenn Speichel in Gegenwart von Saccharose getrocknet wird. Dies impliziert, dass Zucker eine durch Dehydratisierung induzierte Eiweißanhäufung verhindern. Um die Unterschiede zwischen Behandlungsgruppen zu verdeutlichen, die sich schwer im Bereich des Fingerabdrucks von den FTIR-Spektren beobachten lassen, wurden vektornormalisierte Spektren, die aus unter verschiedenen Bedingungen gelagerten Proben gekommen waren, mit der PCA (Principal Component Analysis) Methode analysiert. Diese Bedingungen beziehen sich sowohl auf die Lagerzeiten (bis zu 9 Tagen) als auch auf die Feuchtigkeiten und Temperaturen. Die Proben werden meist auf PC1 getrennt, was ungefähr 60% der beobachteten Varianz beschreibt und eine klare Unterscheidung zwischen Trends und Mustern zwischen behandelten Gruppen (mit oder ohne Saccharose) sowie unterschiedliche Lagerzeiten ermöglicht. Die PCA-Analyse zeigt, dass der auf Filtern in Gegenwart von Saccharose getrocknete Speichel während der Lagerung sowohl unter normalen (% rF <75 oder 4°C) als auch unter beschleunigten Alterungsbedingungen (% rF> 75 oder 37°C) eine höhere Stabilität aufweist, was wiederum die große Leistungsfähigkeit der FT-IR-Spektroskopie in Kombination mit PCA beim frühen Screening von getrockneten Bioproben zeigt. Es wird der Schluss gezogen, dass das trockene Biobanking von Speichel durch Lufttrocknung auf Filtern zur Lagerung und zum Transport von Proben für genetische Feldstudien verwendet werden kann.
In Kapitel 4 wurden die Eigenschaften der Spermien-DNA für Spermienproben untersucht, die unter Verwendung verschiedener Schutzformulierungen getrocknet wurden. Die Auswertung verschiedener Trocknungstemperaturen zeigte, dass in Gegenwart von Lyoprotektiva getrocknete Spermien einen stabilen Glaszustand aufweisen, in dem Biomoleküle immobilisiert und beschädigte Reaktionen verlangsamt werden. Im Gegensatz dazu war die Kristallbildung bei Proben offensichtlich, die nicht mit Zucker und / oder Albumin ergänzt waren. Um die durch Trocknung induzierte ROS-Bildung und DNA-Fragmentierung während der Lagerung zu bewerten, wurden NBT- und SCSA-Assays für Proben mit/ohne Zucker und / oder Albumin durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass in Gegenwart von Schutzmitteln Spermienschäden sowohl hinsichtlich der ROS-Akkumulation als auch der DNA-Fragmentierung verhindert wurden. Zur Beurteilung der gesamten Spermien-DNA-Struktur wurde vor und nach der Trocknung eine FT-IR Analyse durchgeführt. Die Trocknung induzierte den Übergang von B- zu A-ähnlicher DNA und zeigte sich als markante Peakänderungen im Fingerprintbereich, welche spezifisch war für die hydratisierte (B-ähnliche Struktur) und getrocknete (A-ähnliche Struktur) Form. Nach der Trocknung wurde die Reversibilität zur Rehydratisierung auf reine dsDNA sowie Spermien-DNA üntersucht, was einen ähnlichen Trend hinsichtlich der Absorptionsänderungen zeigte. Die Verwendung von Zuckern und Albumin vor der Trocknung erwies sich während der Lagerung bei verschiedenen Temperaturen als effizient, wobei mit PCA erhaltene Bewertungsdiagramme im Vergleich zu Proben ohne Schutzmittel homogener und stabiler (d. h. kompaktere Punkte) erscheinen. Es deutet darauf hin, dass die Trocknung von Spermien in Gegenwart von Zuckern (insbesondere Trehalose) und Albumin Schäden an der DNA-Struktur der Spermien verringert während der Lagerung. Hierbei wurde gezeigt das mit PCA erhaltene Bewertungsdiagramme im Vergleich zu Proben ohne Schutzmittel homogener und stabiler (d. H. Kompaktere Punkte) erscheinen. Es deutet darauf hin, dass das Trocknen von Spermien in Gegenwart von Trehalose und Albumin wirksam ist, um Schäden an der DNA-Struktur der Spermien zu verhindern.

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