Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Analysis of Axon Outgrowth and Calcium Responses in Locust Neurons

Locusts are devastating agricultural pest insects. The food consumption of a comparatively small swarm of 40 million locusts is equivalent to that of 35,000 people. However, locusts are also very amenable for basic research, elucidating principles of insect neurophysiology, neuronal circuitry and neuronal development.

Chemicals that affect the developing nervous system at sub lethal concentrations by effecting changes in structure or function are defined as developmental neurotoxic (DNT) and as such pose a threat to human health worldwide. In the embryonic locust limb, a pair of pioneer neurons navigate to the central nervous system with the aid of guidance cues such as the evolutionary conserved guidance molecule semaphorin. Cytosolic calcium is critically involved in the integration of such guidance molecules. Since molecular mechanisms of axonal guidance are conserved between mammals and insects, the locust pioneer neuron system was established as an alternative to rodent based DNT assays. This locust embryo based assay is capable of detecting DNT effects of endpoint specific controls, affecting cytoskeletal dynamics and cytosolic calcium levels, as well as the accepted DNT compound rotenone. Additionally, I found that elevation of cytosolic calcium disrupts axonal pathfinding. Scanning laser optical tomography (SLOT) was used for metric quantification of axon length and detection of erroneous growth of locust pioneers, which required extensive clearing of tissue for optimal resolution.

Cytosolic calcium can be monitored by the use of calcium indicator dyes. In this dissertation, a membrane permeable calcium indicator was used to record neuronal calcium responses of cultured antennal lobe neurons. The locust antennal lobe contains local interneurons and projection neurons that modulate and relay olfactory information provided by the antenna in glomeruli. The classical transmitter of antennal olfactory receptor neurons is acetylcholine. Given their role in the olfactory circuit, projection neurons and local interneurons were expected to respond differently to cholinergic input. I was able to demonstrate that projection neurons and local neurons indeed respond differently to cholinergic stimulation. In contrast to Drosophila melanogaster, muscarinic stimulation yielded calcium responses in projection neurons. Furthermore, enhanced nicotinic responses were found in local interneurons after nicotinic/muscarinic co-stimulation, similar to findings in Drosophila.

Despite the damages they cause, locusts are a valuable addition to current methodologies of DNT assessment and provide further insight into the olfactory system of a pest insect.

Heuschrecken sind gefürchtete landwirtschaftliche Schadinsekten, da bereits ein vergleichsweise kleiner Schwarm aus 40 Millionen Tieren die gleiche Menge an Nahrung verzehren kann wie 38.000 Menschen. Sie sind jedoch auch zugängliche Modellorganismen, die zur Erforschung neuronaler Schaltkreise, neuronaler Entwicklung und der Neurophysiologie von Insekten genutzt werden.

Substanzen die bei subletalen Konzentrationen die Struktur oder Funktionsfähigkeit des sich entwickelnden Nervensystems verändern können, werden als entwicklungsneurotoxisch (DNT) bezeichnet. Demnach stellen DNT Substanzen weltweit eine Gefahr für die Gesundheit der Menschen dar. In der Entwicklung des Heuschreckenbeins navigieren zwei Pionierneurone selbstständig in das zentrale Nervensystem. Diese Navigation wird durch Wegweisersignale, wie zum Beispiel das evolutionär konservierte Semaphorin, vermittelt. Zytosolisches Kalzium ist bei der Integration verschiedener Wegweisersignale maßgeblich beteiligt. Da die molekularen Mechanismen der Axonalen Wegfindung zwischen Säugern und Insekten konserviert sind, konnten Heuschrecken Pionierneurone als Basis einer Alternative zu nagetierbasierten Testsystemen in der Erkennung von DNT Substanzen genutzt werden. Dieses Testsystem ist in der Lage DNT Effekte endpunktspezifischer Kontrollsubstanzen, welche Zytoskelettgeneration oder Kalziumhomöostase stören, und des entwicklungsneurotoxischen Rotenon zu erfassen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass eine Erhöhung des zytosolischen Kalziumspiegels zu Fehlern in der axonalen Wegfindung führt. Scanning Laser Optical Tomography (SLOT) wurde zur metrischen Bestimmung der Axonlänge und zur Detektion von Wegfindungsfehlern der Pionierneurone eingesetzt. Dieses Verfahren erfordert eine intensive Aufklarung des Gewebes um die dafür notwendige Auflösung zu erzielen.

Mit Hilfe von Kalziumindikatorfarbstoffen können zytosolische Kalziumkonzentrationen bestimmt und nachverfolgt werden. In dieser Dissertation wurde ein membrangängiger Kalziumindikator verwendet, um Kalziumsignale von kultivierten Neuronen des Antennallobus zu Erfassen. Der Antennallobus der Heuschrecke enthält Projektionsneurone und lokale Interneurone, die die von der Antenne vermittelte Geruchsinformation in Glomeruli verarbeiten und weiterleiten. Acetylcholin ist der klassische Neurotransmitter der antennalen olfaktorischen Rezeptorneurone. Es wurde erwartet das Projektionsneurone und lokale Interneurone unterschiedlich auf cholinerge Signale reagieren, da diese unterschiedliche Aufgaben im olfaktorischen Schaltkreis übernehmen. Ich konnte zeigen, dass Projektionsneurone und lokale Interneurone tatsächlich unterschiedlich auf cholinerge Stimulation reagieren. Anders als in Drosophila melanogaster, konnten in Projektionsneuronen von Heuschrecken Kalziumantworten auf muskarinische Stimulation nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden in lokalen Interneuronen nach nikotinischer/muskarinischer Co-stimulation stärkere nikotinische Antworten als bei rein nikotinischer Stimulation beobachtet. Dieser Effekt ähnelt Ergebnissen aus Forschungen an Drosophila.

Trotz der Schäden die sie verursachen, stellen Heuschrecken eine wertvolle Ergänzung zu aktuellen Methoden zur Detektion von DNT Substanzen dar und liefern wertvolle Erkenntnisse über die Funktionsweise des Riechsystems dieser Schadinsekten.

Cite

Citation style:
Could not load citation form.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export