Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Measuring Glucocorticoids and their Metabolites in Hair and Faeces of Polar Bears (Ursus maritimus)

The presented study is focused on the non-invasive measurement of the glucocorticoid cortisol and its metabolites in hair and faecal samples of zoo polar bears.

In the first part of the study a group-specific enzyme immunoassay (EIA) was analytically and biologically validated for the analysis of faecal glucocorticoid metabolites (FGMs). The assay was then applied to determine polar bear FGM levels of both sexes over a one-year period for the first time, also taking into account different factors possibly influencing FGMs. Results of this longitudinal FGM analysis showed that especially social conflicts, environmental changes and transports lead to an increase of FGM levels, while breeding season and sex did not influence FGM concentrations of the five monitored bears.

In this context, big inter- and intra-individual differences in the measured FGM levels could be detected, making the establishment of general reference values for polar bears rather useless. Further, statistical analysis of the obtained data revealed a significant influence of sample age on the measured values.

In the second part of the study two different immunoassays and liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) were used for comparative analysis of cortisol in polar bear hair samples. Measured hair cortisol concentrations (HCCs) showed clear differences depending on the applied analytical technique, whereas a different degree of sample processing (cut vs. powdered hair) had no significant effect on HCCs by either method.

HCC measurement in polar bears was for the first time analytically and biologically validated for one immunoassay and LC-MS/MS. The validated LC-MS/MS was subsequently used to determine cortisol, cortisone, testosterone and progesteronelevels from hair samples collected over 9 months from six captive polar bears. No seasonal steroid variation was observed except in male progesterone levels. For all steroids except cortisone, a strong effect of the sampled body region (neck or paw) was observed.

It can be concluded that both, measuring FGMs as well as HCCs in polar bears is possible by the use of the presented validated analytical techniques and obtained data are biologically relevant, i.e. reflecting individual mid- to long-term stress load. Furthermore, when applying LC-MS/MS for analysing hair samples, the assessment of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis can be complemented by evaluation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis or the measurement of other hormones in hair. A clear method dependence of the measured values impedes a direct comparison of results from different studies. The findings of the presented work provide basic endocrinological data and useful criteria to guide future studies aimed at the non-invasive measurement of glucocorticoids in polar bears.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die non-invasive Messung des Glukokortikoids Cortisol, beziehungsweise dessen Metaboliten, in Haar- und Kotproben von Zoo-Eisbären. Dabei wurde im ersten Teil der Studie ein gruppenspezifischer Enzymimmunoassay (EIA) für die Messung von fäkalen Glukokortikoidmetaboliten (FGMs) analytisch und biologisch validiert.  Anschließend wurden unter Anwendung des Assays erstmalig FGM-Konzentrationen von Eisbären beider Geschlechter und unter Einbeziehung verschiedener möglicher Einflussfaktoren über eine Einjahresperiode erhoben. Die Ergebnisse der Langzeitmessung von FGMs zeigten, dass vor allem soziale Konflikte, Umweltveränderungen und Transporte einen Anstieg von FGMs bewirkten, wohingegen Paarungszeit und Geschlecht keinen Einfluss auf FGM-Konzentrationen der fünf untersuchten Bären hatten. Besonders hervorzuheben sind außerdem die großen inter- und intra-individuellen Unterschiede in den gemessenen FGM-Konzentrationen, die ein Erheben von allgemeinen Referenzwerten wenig sinnvoll machen. Außerdem zeigte die statistische Aufarbeitung der gemessenen FGMs einen deutlichen Einfluss des Probenalters auf das Messergebnis.

Im zweiten Teil der Arbeit wurden zunächst zwei unterschiedliche Immunoassays und Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) zur Messung von Cortisol in Eisbärhaaren vergleichend herangezogen. Die gemessenen Haarcortisolkonzentrationen (HCCs) zeigten deutliche Unterschiede in Abhängigkeit von der angewandten Analysetechnik, ein unterschiedlicher Grad der Probenzerkleinerung (geschnittenes vs. gemahlenes Haar) jedoch hatte in keiner der drei Analysetechniken einen signifikanten Einfluss auf die HCCs. Anschließend wurden erstmalig ein Immunoassay und die LC-MS/MS für die Analyse von Eisbär-HCCs analytisch und biologisch validiert. Durch die Verwendung der validierten LC-MS/MS-Methode konnten nachfolgend über einen 9-Monats-Zeitraum gesammelte Haarproben von sechs Zooeisbären nicht nur auf Cortisol, sondern auch auf Cortison, Progesteron und Testosteron untersucht werden. Eine saisonale Variation wurde dabei nur bei den Progesteronkonzentrationen der männlichen Eisbären beobachtet, wohingegen ein starker Effekt der Haarentnahmestelle (Hals oder Pfote) für alle untersuchten Steroide außer Cortison festgestellt werden konnte.

Abschließend kann gesagt werden, dass sowohl die Messung von FGMs, als auch von HCCs bei Eisbären anhand der vorgestellten validierten Analysetechniken möglich ist und die dabei gewonnenen Daten von biologischer Relevanz sind- sie geben eine individuelle mittel- bis langfristige Stressbelastung wieder. Zudem kann bei Verwendung der LC-MS/MS für die Untersuchung von Haarproben die Beurteilung der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse (HPA-Achse, Stressachse) noch durch die Bewertung der Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse (HPG-Achse) oder die Messung weiterer Hormone im Haar ergänzt werden. Eine deutliche Methodenabhängigkeit der gemessenen Werte macht einen direkten Ergebnisvergleich verschiedener Studien schwierig. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern neben grundlegenden endokrinologischen Daten wichtige Anhaltspunkte und praktische Handlungsanweisungen für zukünftige Forschungsarbeiten im Zusammenhang mit der non-invasiven Messung von Glukokortikoiden bei Eisbären.

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