Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zu antibakteriellen Wirkstoffen aus der Produktmikrobiota von traditionell und industriell hergestellten Rohwurstprodukten

Die Verbrauchernachfrage nach natürlichen, nicht mit künstlichen Zusätzen behandelten Lebensmitteln in Deutschland ist steigend. Gleichzeitig werden auch vermehrt Ready-to-eat-Produkte bezogen, welche vor dem Verzehr keinen weiteren Zubereitungsschritten unterzogen werden, wie z.B. einer thermischen Behandlung. In dieser Produktgruppe werden jedoch regelmäßig pathogene Bakterien gefunden, darunter z.B. L. monocytogenes, welche durch Postprocessing-Schritte, wie das Schneiden und Verpacken, in das Produkt durch Rekontamination eingebracht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwieweit sich antibakterielle Wirkstoffe von Milchsäurebakterien aus der Mikrobiota von Rohwurstprodukten deutscher Herstellung zur Verbesserung der Produkt- und Verbrauchersicherheit von RTE-Brühwurstaufschnitt eignen. Im ersten Teil des Projektes wurden Milchsäurebakterien von fermentierten Rohwürsten (n=70) aus deutscher Herstellung isoliert. Die Rohwurstprodukte wurden zur Hälfte von Discountern bzw. Einzelhandelsketten (industrielle Produkte) erworben während die übrigen 35 Rohwürste von traditionellen Handwerksbetrieben (traditionelle Produkte) produziert wurden. Bei den großindustriell hergestellten Produkten wurden vorwiegend Reifekulturen eingesetzt. Die traditionell gefertigten Rohwürste waren hingegen bis auf eine frei von zugefügten Reifekulturen. Insgesamt wurden 169 Milchsäurebakterienisolate gewonnen und mittels MALDI-TOF-MS identifiziert. Im Agar-Well-Diffusionstest konnte im zellfreien Kulturüberstand von 21 der 169 untersuchten Milchsäurebakterien ein antibakterieller Effekt gegen L. monocytogenes DSM19049und L. innocua DSM 20649 gezeigt werden. Bei 11 Isolaten der Genera Lactobacillus spp. und Pediococcus spp. wurde dieser Effekt auf im ZFK enthaltene Bakteriozine als antibakteriell wirkende Substanzen zurückgeführt. Die Bakteriozine im ZFK zeigten sich sowohl gegenüber hohen und niedrigen Temperaturen und bei Veränderungen des pH-Wertes als stabil. Zwei Pediococcus spp.-Isolate (P. acidilactici LMQS 154.1; P. pentosaceus LMQS 313.1) wurden für weitere Untersuchungen anhand ihrer Wachstumscharakteristika und antimikrobiellen als auch physikochemischen Eigenschaften für weitere Untersuchungen ausgewählt. Hier konnte - durch Fällung der Bakteriozine im zellfreien Kulturüberstand mittels Ammoniumsulfat - die Bakteriozinkonzentration und damit auch die relative Bakteriozinaktivität pro Milliliter erhöht werden. Ein erweitertes Panel von 11 lebensmittelassoziierten Listeria spp.-Stämmen zeigte sich gegenüber diesen konzentrierten Bakteriozinaufbereitungen empfindlich. Dabei zeigten sich die L. monocytogenes-Stämme empfindlicher gegenüber den Bakteriozinen als die L. innocua-Stämme. Weiterhin konnte mittels real-time PCR in beiden Pediococcus spp.-Isolaten Bakteriozinstrukturgene (pedA Gene) nachgewiesen werden, die zu 100 % der Gensequenz des P. pentosaceus-Stammes LJR1 Pediocin PA-1 (pedA) (NCBI, GenBank accession number KY038164.1) entsprachen. Im zweiten Teil des Projekts wurde deutlich, dass die antimikrobiellen Wirkungen von LAB, ZFK oder konzentrierten Bakteriozinzubereitungen, die im ersten Teil des Projekts beobachtet wurden, nicht direkt auf die Testbedingungen in den Challengetests mit Brühwurst übertragbar waren. Die in Challengetest A und B eingesetzten Milchsäurebakterienkulturen konnten sich unter den Lagerungsbedingungen auf der Matrix nicht ausreichend vermehren, sodass weder durch direkte Konkurrenz noch durch die wachstumsassoziierte Bildung von Bakteriozinen ein Effekt auf die Keimzahlentwicklung von L. monocytogenes oder B. thermosphacta erreicht werden konnte. Auch bei dem Einsatz von zellfreiem Kulturüberstand, der direkt aus einer 48 h-Kultur gewonnen wurde, war kein signifikanter antibakterieller Effekt zu beobachten. Im dritten Challengetest konnte durch Anwendung konzentrierter Bakteriozinzubereitungen von P. acidilactici LMQS 154.1 und P. pentosaceus LMQS 331.3 das Wachstum von L. monocytogenes über 21 Tage gehemmt werden. Für B. thermosphacta – obwohl zu den Listeriaceae gehörend – konnte in diesen Untersuchungen keine Beeinflussung durch Milchsäurebakterienkultur, ZFK, ZFKconc oder die Verpackungsart festgestellt werden. Insgesamt konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass sich Rohwürste deutscher Herstellung als Quelle für Milchsäurebakterien mit antibakteriellem Potential eignen. Dabei konnten unter anderem Bakteriozine als antibakteriell wirksame Stoffgruppe identifiziert und weiter charakterisiert werden. Im Challengetest auf einer Ready-to-eat Brühwurstmatrix konnten aufkonzentrierte Bakteriozinzubereitungen das Wachstum von L. monocytogenes signifikant hemmen. Der Einsatz von Bakteriozinen auf verzehrsfertigen Fleischprodukten kann somit der Verbesserung der Produkt- und Verbrauchersicherheit dienen.

In Germany, the consumers´ demand for natural foods without artificial additives is increasing. At the same time, more and more RTE-products are being purchased which are not subjected to any further preparation steps before consumption, such as thermal treatment. In this product group, however, pathogens including e.g. L. monocytogenes are regularly found, which are introduced into the product through post-processing steps such as cutting and packaging. The aim of the present work was therefore to examine if antibacterial active substances of lactic acid bacteria (LAB) obtained from the microbiota of raw sausage products of German production were suitable for improving the product and consumer safety of RTE cooked sausage slices. In the first part of the project, lactic acid bacteria were isolated from fermented raw sausages (n=70) of German production. Half of the raw sausage products were purchased from discounters or retail chains (industrial products) while the other 35 sausages were produced by traditional small-scale manufacturers (traditional products). Ripening cultures were predominantly used for the large-scale industrially manufactured products. The traditionally produced raw sausages investigated in this study were - except for one - free of added ripening cultures. A total of 169 isolates of lactic acid bacteria were obtained from the raw sausage samples and identified via MALDI-TOF-MS. In Agar Well Diffusion Assays, an antibacterial effect against L. monocytogenes DSM 19094 and L. innocua DSM 20649 could be shown in the cell-free culture supernatant ZFK of 21 out of 169 examined lactic acid bacteria. In 11 isolates of the genera Lactobacillus spp. and Pediococcus spp. this effect was attributed to bacteriocins contained in the ZFK as antibacterial substances. The bacteriocins in the CFS proved to be stable both at high and low temperatures and at changes in the pH-values of the media. Two Pediococcus spp. isolates (P. acidilactici LMQS 154.1; P. pentosaceus LMQS 313.) were selected for further investigations on the basis of their growth characteristics and antimicrobial as well as physicochemical properties. Here, the bacteriocin concentration and thus also the relative bacteriocin activity per milliliter could be increased by ammonium sulfate precipitation. An extended panel of eleven food-associated Listeria spp. strains were sensitive to these concentrated bacteriocin preparations. All in all, L. monocytogenes strains have shown to be more sensitive towards the bacteriocin than L. innocua strainsFurthermore, real-time PCR was performed for both aforementioned Pediococcus spp. isolates to detect bacteriocin structure genes (pedA genes) that corresponded 100 % to the gene sequence of the P. pentosaceus strain LJR1 Pediocin PA-1 (pedA) (NCBI, GenBank accession number KY038164.1). In the second part of the project, it became clear that the antimicrobial effects of LAB, CFS or concentrated bacteriocin preparations that were observed in the first part of the project were not directly transferable to the test conditions in the challenge test with bologna type sausages. The LAB used in challenge tests A and B could not reproduce sufficiently under the given storage conditions, so that neither direct competition nor growth-associated bacteriocin formation could affect the growth of L. monocytogenes or B. thermosphacta. Also, no significant antibacterial effect was observed when using CFS obtained directly from a 48 h culture. Presumably, the efficacy of bacteriocins in food was limited by matrix effects and a resulting lower effective bacteriocin concentration. In the third challenge test, concentrated bacteriocin preparations of P. acidilactici LMQS 154.1 and P. pentosaceus LMQS 331.3 inhibited the growth of L. monocytogenes for 21 on the bologna type sausage matrix. For B. thermosphacta growth - although belonging to the Listeriaceae family - no influence of lactic acid bacteria culture, CFS, concentrated bacteriocin preparation or packaging type could be detected in this study. Overall, this work showed that raw sausages produced in Germany are a source of lactic acid bacteria with antibacterial potential. Among others, bacteriocins could be identified and further characterized as antibacterial substances. In the challenge test on a ready-to-eat emulsion type sausage, concentrated bacteriocin preparations were able to significantly inhibit the growth of L. monocytogenes. The use of bacteriocins on ready-to-eat meat products could therefore improve product and consumer safety.

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