Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Einfluss von Beta-Hydroxybutyrat auf bovine plazentare Fibroblasten in-vitro

Die negative Energiebilanz stellt eine pathologische Stoffwechsellage der Milchviehrinder dar. Die aus ihr resultierenden Ketose ist eine der bedeutsamsten buiatrischen Erkrankungen in der modernen Milchviehhaltung und ist die nahezu zwingende Konsequenz der Unfähigkeit der Rinder, den massiven Energieverlust im Rahmen der einsetzenden Laktation durch genügend Futteraufnahme zu kompensieren. Die Ketose stellt hierbei die Folge der Lipolyse zur Mobilisierung von Körperfett als Energiereserve dar und Beta-Hydroxybutyrat (BHB) gilt als der wichtigste Ketonkörper der bovinen Ketose. Die Folgen der Ketose sind enorm vielfältig und umfassen neben zahlreichen Einschränkungen der bovinen Reproduktionsleistung auch eine erhöhte Zahl an Nachgeburtsverhaltungen (NGV). Die Rolle der EZM und von Fibroblasten ist während der Trächtigkeit und dem Lösen der fetomaternalen Verbindung enorm. Daher wurde in dieser Arbeit der Einfluss von Merkmalen einer negativen Energiebilanz auf bovine plazentare Fibroblasten in-vitro untersucht. Für die Versuche wurden bovine plazentare Fibroblasten mit BHB für 24 Stunden (und im Falle der Untersuchungen des Zellmetabolismus' zusätzlich für 36 Stunden) stimuliert. Die Fibroblasten wurden hinsichtlich ihres Zellmetabolismus', ihrer Zellmotilität und ihres Expressionsverhaltens auf mRNA- und Proteinebene untersucht. Zur Untersuchung der Genexpression wurden MMP2 (Matrixmetalloproteinase 2), MMP14, Col1A1 (Kollagen 1A1), Col4A1, TNF-alpha (Tumornekrosefaktor-alpha), IL-6 (Interleukin-6) und Lam C (Laminin C) in der qRT-PCR (quantitativen Realtime-PCR) untersucht. MMP2 und MMP14 wurden aufgrund ihrer zentralen, herausragenden Rolle in der Gestaltung der extrazellulären Matrix (EZM) auch auf Proteinebene im Western-Blot untersucht. Abschließend wurden mittels MTT-Assay (Zellmetabolismus) und Live Cell Imaging (Zellmotilität) biologische Wirkungen von BHB ermittelt. Die Untersuchungen der Genexpression zeigten eine erhöhte mRNA (messenger RNA)-Expression von MMP2 durch 1,8 mM BHB (2,16-fach). Ebenso wurde das mRNA-Expressionsverhalten von \newline MMP14 durch 2,4 mM BHB (5,19-fach) signifikant gesteigert. Das mRNA-Expressionsverhalten der Kollagene Col1A1 und Col4A1 wurde durch 1,8 mM BHB (Col1A1: 3,1-fach; Col4A1: 2,87-fach) und 2,4 mM BHB (Col1A1: 4,28-fach; Col4A1: 4,55-fach) signifikant gesteigert. Col4A1 wurde zusätzlich durch 1,2 mM BHB in seinem mRNA-Expressionsverhalten signifikant beeinflusst (1,94-fache Steigerung). Eine signifikante Steigerung der mRNA-Expression lag letztlich auch bei TNF-alpha unter dem Einfluss von 1,8 mM BHB (2,06-fach) vor. Die Motilität der Fibroblasten wurde durch 1,2 mM BHB (1,11-fach) signifikant gesteigert. Durch 1,8 mM BHB wurde die Motilität signifikant auf das 0,79-fache Niveau gesenkt, während die Motilität bei 2,4 mM BHB auf das 0,49-fache Niveau gesenkt wurde. Der Zellmetabolismus wurde nach 24 Stunden durch 0,6 mM BHB signifikant 1,15-fach gesteigert. Durch 1,2 mM BHB wurde eine signifikante, 1,13-fache Steigerung des Zellmetabolismus' hervorgerufen. Nach 36 Stunden wurde der Zellmetabolismus durch 0,6 mM- (auf das 0,85-fache), durch 1,2 mM- (auf das 0,84-fache), durch 1,8 mM- (auf das 0,76-fache) und durch 2,4 mM BHB (auf das 0,69-fache) signifikant gesenkt. In der vorgelegten Arbeit konnten Einflüsse von BHB auf den Zellmetabolismus, die Motilität und das Expressionsverhalten von bovinen plazentaren Fibroblasten nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse führten zu folgender Arbeitshypothese. Durch BHB wird in bovinen plazentaren Fibroblasten eine initiale Entzündungsreaktion durch Überexpression von TNF-alpha hervorgerufen. Diese Entzündungsreaktion hat eine gesteigerte Expression von MMP2 und MMP14 zur Folge. Die Expression von Col1A1 und Col4A1 könnte als direkte Konsequenz des Einflusses von BHB gesteigert sein. Neben diesen Expressionsveränderungen beeinflusst BHB auch die Zellmotilität ab einer Konzentration von 1,8 mM in Form einer Herabsenkung. Der Zellmetabolismus wird hingegen erst nach über 24 Stunden herabgesetzt. Aufgrund der Bedeutung von Kollagenen, Entzündungsmediatoren und MMP in der Pathogenese diverser Uteropathien und anderer boviner Reproduktionsstörungen ist es vorstellbar, dass BHB, durch Beeinflussung der Fibroblastenfunktionalität zu gestörter EZM-Gestaltung führt, die als Folge auch eine NGV nach sich ziehen könnte. Weiterführend können die Ergebnisse dieser Arbeit helfen, die pathologischen Prozesse einer Ketose im Uterus auf molekularbiologischem und mikroskopischem Niveau zu verstehen.

Negative energy balance represents a pathological deviation in dairy cow metabolism. As lipolysis sets in to mobilise body fat as an energy depot, ketosis is one of the repercussions and is widely considered as one of the most important buiatric diseases. This ketosis is the virtually unavoidable consequence of the inability of dairy cows to compensate the immense energy loss at the onset of lactation through sufficient food intake. Beta-hydroxybutyrate (BHB) is considered the most important ketone body in this process. The consequences of ketosis are enormously diverse and entail, next to various impairments of bovine reproductive ability, an increased number of retained fetal membranes. The role of the extracellular matrix (ECM) and fibroblasts during gestation and separation of the fetomaternal connection at parturition can not be overstated. Therefore, this study investigated the effects of characteristics of a negative energy balance on bovine placental fibroblasts in-vitro. For the experiments, fibroblasts were stimulated with BHB for 24 hours (and for 36 hours in the case of cell metabolism analysis). Fibroblasts were analysed in regards to their cell metabolism, their motility and their mRNA- and protein expression. To analyse the gene expression MMP2 (matrix metallorproteinase 2), MMP14, Col1A1 (collagen 1A1), Col4A1, TNF-alpha (tumor necrosis factor-alpha, IL-6 (interleukin-6) and Lam C (laminin C) were analysed in their mRNA (messenger RNA)-expression pattern via qRT-PCR (quantitative Realtime-PCR). Due to their central, dominant role in the composition of the ECM, MMP2 and MMP14 were further analysed in their protein expression pattern. To conclude the analyses, cell metabolism (via MTT-assay) and cell motility (via live cell imaging) were investigated as examples for biological effects. The analyses of gene expressions showed a significant increase in mRNA expression of MMP2 by 1.8 mM BHB (2.16-fold). MMP14 was also affected by 2.4 mM BHB stimulation in its mRNA expression (5.19-fold increase). The mRNA expression of Col1A1 and Col4A1 was significantly increased by 1.8 mM BHB (Col1A1: 3.1-fold; Col4A1: 2.87-fold) and 2.4 mM BHB (Col1A1: 4.28-fold; Col4A1: 4,55-fold). Col4A1 mRNA expression was additionally significantly increased by 1.2 mM BHB (1.94-fold). A significant increase in mRNA expression could lastly be observed for TNF-alpha, where 1.8 mM BHB increased the expression 2.06-fold. At protein level, MMP2 and MMP14 were detected in all groups but showed no significant differences in regards to their protein expression. Fibroblast motility was significantly increased by 1.2 mM BHB (1.11-fold), while 1.8 mM BHB and 2.4 mM BHB decreased motility significantly (0.76-fold and 0.49-fold, respectively). Cell metabolism was increased after 24 hours under the influence of 0.6 and 1.2 mM BHB (1.15-fold and 1.13-fold, respectively). After 36 hours cell metabolism was decreased significantly for all BHB concentrations (0.6 mM: 0.85-fold; 1.2 mM: 0.84-fold; 1.8 mM: 0.76-fold; 2.4 mM: 0.69-fold). The presented study demonstrated effects of BHB on fibroblast motility, -metabolism and gene expression. These results led to the following hypothesis. BHB leads to an initial inflammatory reaction in bovine placental fibroblasts by overexpression of TNF-alpha. This inflammatory process in turn leads to an increased expression of MMP2, MMP14. Expression of Col1A1 and Col4A1 could be increased as a direct repercussion of BHB influence. Next to these gene expression changes, BHB also leads to alterations in cell motility at a concentration of at least 1.8 mM. Cell metabolism was affected only after at least 24 hours. Because of the importance of collagens, inflammatory mediators and MMPs in the pathogenesis of not only various uteropathies but also of many other bovine reproductive ailments, it is fathomable that BHB, by influencing fibroblast functionality, can lead to impaired ECM composition, which can in turn lead to failed separation of fetal membranes. These results can also help to understand the pathological processes of ketosis on the bovine uterus at a molecular biological and microscopic level.

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