Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Innate immune response in the Streptococcus suis infected CSF compartment : role of DNases and antimicrobial peptides

Meurer, Marita GND

Bakterielle Meningitis ist eine sehr schwere Erkrankung bei der neutrophile Granulozyten in die Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) einwandern. Streptococcus (S.) suis ist ein bedeutender Krankheitserreger, der unter anderem als Zoonoseerreger bei Schwein und Mensch zu Meningitiden führen kann und dadurch auch große wirtschaftliche Verluste in den Schweinebeständen verursacht. Um die Infektion zu bekämpfen, können die neutrophilen Granulozyten die Bakterien phagozytieren oder extrazelluläre DNA-Netze (NETs) bilden, in denen die Bakterien gefangen, an der weiteren Ausbreitung gehindert und teilweise abgetötet werden. Einige Bakterien wie beispielsweise S. suis haben die Fähigkeit, DNasen zu produzieren, um den Einschluss in NETs zu vermeiden. Die NETs scheinen jedoch durch kationische Wirtspeptide, die Cathelicidine, die ebenfalls aus den Granulozyten freigesetzt werden, gegen den Abbau durch bakterielle DNasen stabilisiert zu werden. Ein Ziel dieser Arbeit ist es, die Rolle von DNasen, Cathelicidinen und NETs bei der Wirts-Abwehr von S. suis-Infektionen zu charakterisieren. Im ersten Teil dieser Studie haben wir ein Zellkulturmodell der porcinen Blut-CSF-Schranke etabliert. Diese Barriere ist die wichtigste Eintrittspforte für S. suis ins CSF um zu den Meningen zu gelangen. In unserem 3D-Zellkulturmodell kann die Transmigration von Pathogenen und Neutrophilen durch eine Barriere aus porcinen Choroid Plexus Epithelzellen studiert werden. Im zweiten Teil dieser These haben wir uns das Infektionsgeschehen im natürlichen Wirt von S. suis, dem Schwein, genauer angesehen. Mit Hilfe eines Meningitis-Modells, nach intranasaler Infektion von Ferkeln, haben wir herausgefunden, dass die bakterielle DNase SsnA nicht essentiell für die Virulenz des von uns verwendeten S. suis-Serotyp 2 Stamm 10 Stammes ist. Im CSF bilden neutrophile Granulozyten im Verlauf einer Infektion NETs, die von dem antimikrobiellen Peptid PR-39 gegen einen DNase-abbau geschützt werden können. In histologischen Untersuchungen der infizierten Meningen und des Plexus choroideus konnten keine NET-Strukturen, sondern nur NET-Marker, wie DNA-Histon-Komplex und Elastase, nachgewiesen werden, was darauf hinweist, dass diese Strukturen hier von DNasen abgebaut wurden, um das empfindliche Gewebe vor langen NETs-Fasern zu schützen. Da auch in CSF von Tieren, die mit einem S. suis Stamm, der die DNase SsnA nicht produzieren kann, infiziert waren, eine hohe DNase-aktivität gefunden wurde, gehen wir davon aus, dass der Wirt mit eigenen DNasen, das Vorhandensein freier DNA im CSF kontrolliert. Eine Produktion von DNase in Choroid Plexus Epithelzellen in Tieren mit klinischer Meningitis konnte ebenfalls histologisch bestätigt werden. Interessanterweise wurde eine kapsellose S. suis Mutante in vitro in Anwesenheit von Plasma und DNase durch neutrophile Granulozyten stärker eliminiert als ohne DNase, was auf eine immunmodulierende Rolle der Wirts-Nukleasen hinweist. Eine herausragende Bedeutung von DNase auf die Abtötung von S. suis zeigte sich für bekapselte S. suis in vitro jedoch nicht. Insgesamt deuten die Ergebnisse daraufhin, dass, neben NET-stabilisierenden Cathelicidinen, DNasen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Immunantwort während einer S. suis Meningitis spielen. Zusätzlich haben wir uns mit der antimikrobiellen Wirksamkeit von den Cathelicidinen LL-37 und PR-39 in CSF befasst. Ihr Einfluss auf das Meningitisgeschehen ist noch nicht geklärt. Zur Feststellung der antimikrobiellen Wirksamkeit von Stoffen, wird die minimale Hemmkonzentration (MHK) bestimmt. Um eine routinemäßige MHK Testung und damit eine Abschätzung der antimikrobiellen Wirksamkeit der Cathelicidine im Labor zu ermöglichen, wurde auch nach geeigneten Medien gesucht, in denen die gleichen MHK Ergebnisse wie im CSF zu erwarten sind, da die Standard MHK-Testung die antimikrobielle Wirkung im Körper oftmals nicht korrekt abbildet. Unsere Daten zeigten, dass MHK-Werte, die in dem von der CLSI empfohlenen Testmedium, der Kation-adjustierten Mueller-Hinton Boullion (CA-MHB), generiert wurden, nicht die MHKs wiederspiegelten, die wir im CSF als natürlichem Medium erhielten. Jedoch konnten in, mit CA-MHB-angereichertem, Zellkulturmedium ähnliche MHK-Werte für klinische S. suis Isolate erzielt werden, wie in dem physiologischen Testmedium CSF. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit einer Empfindlichkeitsprüfung von antimikrobiellen Peptiden in einem Medium, das die klinisch relevanten Bedingungen genau imitiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Daten dieser Arbeit neue Erkenntnisse über die Rolle von DNasen, Cathelicidinen und NETs bei der Abwehr von S. suis-Infektionen durch den Wirt liefern. Darum kann diese Arbeit zu einem besseren Verständnis des Wirt- Erreger- Interaktionen während einer S. suis Meningitis beitragen.

Bacterial meningitis is a severe disease in which a large number of neutrophil granulocytes migrate into the cerebrospinal fluid (CSF). Streptococcus (S.) suis is an important pathogen which, leads to large economic losses in pig industry and has also become increasingly important as a zoonotic pathogen leading to meningitis in pigs and humans. To fight the infection, neutrophils can either phagocyte the bacteria or form extracellular traps (NETs) in which the bacteria are trapped, prevented from further spreading and partially killed. S. suis has the ability to produce DNases to avoid entrapment by NETs. However, during host-pathogen interaction the NETs are stabilized against degradation by bacterial DNases with host cationic peptides, the cathelicidins, which are also released from the granulocytes. A goal of this thesis is to characterize the role of DNases, cathelicidins and NETs during the host defense against S. suis infections. In the first part of this study, we established a cell culture model of the porcine blood CSF barrier (BCSFB). This barrier is the key entrance port for S. suis to enter the meninges. In this 3D cell culture model, the transmigration of pathogens as well as neutrophils through a barrier of porcine choroid plexus epithelial cells can be studied. In the second part of this thesis, we characterized the role of bacterial and host nucleases in host-pathogen interaction in the pig. Using a meningitis model after intranasal infection of piglets, we identified that the bacterial DNase SsnA was not essential for the virulence S. suis serotype 2 Strain 10 we used. During the course of infection, neutrophils form NETs in the CSF, which seem to be protected against DNase degradation by the antimicrobial peptide PR-39. In histological analyses of the infected meninges and the choroid plexus, no NET structures could be detected but NET markers, such as DNA-histone-1-complexes and elastase, indicating that the complex structures are degraded by DNases to protect the sensitive tissue against long NET fibers. Since high DNase activity was also found in CSF of animals infected with S. suis that are unable to produce the DNase SsnA, we assume that the host with its own DNases controls the presence of free DNA in CSF. A presence of DNase in choroid plexus epithelial cells in animals with clinical meningitis was also histologically confirmed. Interestingly, in vitro an unencapsulated S. suis mutant is more effectively eliminated by neutrophil granulocytes in the presence of plasma and DNase than without DNase, indicating an immunomodulating role of host nucleases. However, an outstanding role of DNase in modulating neutrophil killing of encapsulated S. suis could not be confirmed in vitro. Overall, the results suggest that besides NET-stabilizing cathelicidins, also DNases play an important role in the regulation of the immune response during S. suis meningitis. In addition, we investigated the antimicrobial activity of the cathelicidins LL-37 and PR-39 in CSF. Their influence on meningitis has not yet been clarified. In order to assess the antimicrobial efficacy, the minimum inhibitory concentration (MIC) was tested. To enable routine testing of the MIC, we looked for suitable media in which the same MIC results as in CSF can be expected, since standard MIC testing often does not correctly reflect the antimicrobial effect in the body. Our data showed that MICs obtained in cation adjusted Mueller-Hinton broth (CA-MHB) as recommended by CLSI did not reflect the MICs obtained in the physiological body fluid CSF. We found that the MICs of clinical isolates of S. suis tested in cell culture medium supplemented with CA-MHB, were similar to those of the same strains tested in CSF. This highlights the need for susceptibility testing of AMPs in a medium that closely mimics the clinically relevant conditions. In summary, the data of this thesis provides new knowledge about the role of DNases, cathelicidins and NETs during the host defense against S. suis infection. Therefore, this work may contribute to a better understanding of the host-pathogen interaction during S. suis meningitis.

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