Innate immune response in the Streptococcus suis infected CSF compartment : role of DNases and antimicrobial peptides

Bakterielle Meningitis ist eine sehr schwere Erkrankung bei der neutrophile Granulozyten in die Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) einwandern. Streptococcus (S.) suis ist ein bedeutender Krankheitserreger, der unter anderem als Zoonoseerreger bei Schwein und Mensch zu Meningitiden führen kann und dadurch auch große wirtschaftliche Verluste in den Schweinebeständen verursacht. Um die Infektion zu bekämpfen, können die neutrophilen Granulozyten die Bakterien phagozytieren oder extrazelluläre DNA-Netze (NETs) bilden, in denen die Bakterien gefangen, an der weiteren Ausbreitung gehindert und teilweise abgetötet werden. Einige Bakterien wie beispielsweise S. suis haben die Fähigkeit, DNasen zu produzieren, um den Einschluss in NETs zu vermeiden. Die NETs scheinen jedoch durch kationische Wirtspeptide, die Cathelicidine, die ebenfalls aus den Granulozyten freigesetzt werden, gegen den Abbau durch bakterielle DNasen stabilisiert zu werden. Ein Ziel dieser Arbeit ist es, die Rolle von DNasen, Cathelicidinen und NETs bei der Wirts-Abwehr von S. suis-Infektionen zu charakterisieren. Im ersten Teil dieser Studie haben wir ein Zellkulturmodell der porcinen Blut-CSF-Schranke etabliert. Diese Barriere ist die wichtigste Eintrittspforte für S. suis ins CSF um zu den Meningen zu gelangen. In unserem 3D-Zellkulturmodell kann die Transmigration von Pathogenen und Neutrophilen durch eine Barriere aus porcinen Choroid Plexus Epithelzellen studiert werden. Im zweiten Teil dieser These haben wir uns das Infektionsgeschehen im natürlichen Wirt von S. suis, dem Schwein, genauer angesehen. Mit Hilfe eines Meningitis-Modells, nach intranasaler Infektion von Ferkeln, haben wir herausgefunden, dass die bakterielle DNase SsnA nicht essentiell für die Virulenz des von uns verwendeten S. suis-Serotyp 2 Stamm 10 Stammes ist. Im CSF bilden neutrophile Granulozyten im Verlauf einer Infektion NETs, die von dem antimikrobiellen Peptid PR-39 gegen einen DNase-abbau geschützt werden können. In histologischen Untersuchungen der infizierten Meningen und des Plexus choroideus konnten keine NET-Strukturen, sondern nur NET-Marker, wie DNA-Histon-Komplex und Elastase, nachgewiesen werden, was darauf hinweist, dass diese Strukturen hier von DNasen abgebaut wurden, um das empfindliche Gewebe vor langen NETs-Fasern zu schützen. Da auch in CSF von Tieren, die mit einem S. suis Stamm, der die DNase SsnA nicht produzieren kann, infiziert waren, eine hohe DNase-aktivität gefunden wurde, gehen wir davon aus, dass der Wirt mit eigenen DNasen, das Vorhandensein freier DNA im CSF kontrolliert. Eine Produktion von DNase in Choroid Plexus Epithelzellen in Tieren mit klinischer Meningitis konnte ebenfalls histologisch bestätigt werden. Interessanterweise wurde eine kapsellose S. suis Mutante in vitro in Anwesenheit von Plasma und DNase durch neutrophile Granulozyten stärker eliminiert als ohne DNase, was auf eine immunmodulierende Rolle der Wirts-Nukleasen hinweist. Eine herausragende Bedeutung von DNase auf die Abtötung von S. suis zeigte sich für bekapselte S. suis in vitro jedoch nicht. Insgesamt deuten die Ergebnisse daraufhin, dass, neben NET-stabilisierenden Cathelicidinen, DNasen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Immunantwort während einer S. suis Meningitis spielen. Zusätzlich haben wir uns mit der antimikrobiellen Wirksamkeit von den Cathelicidinen LL-37 und PR-39 in CSF befasst. Ihr Einfluss auf das Meningitisgeschehen ist noch nicht geklärt. Zur Feststellung der antimikrobiellen Wirksamkeit von Stoffen, wird die minimale Hemmkonzentration (MHK) bestimmt. Um eine routinemäßige MHK Testung und damit eine Abschätzung der antimikrobiellen Wirksamkeit der Cathelicidine im Labor zu ermöglichen, wurde auch nach geeigneten Medien gesucht, in denen die gleichen MHK Ergebnisse wie im CSF zu erwarten sind, da die Standard MHK-Testung die antimikrobielle Wirkung im Körper oftmals nicht korrekt abbildet. Unsere Daten zeigten, dass MHK-Werte, die in dem von der CLSI empfohlenen Testmedium, der Kation-adjustierten Mueller-Hinton Boullion (CA-MHB), generiert wurden, nicht die MHKs wiederspiegelten, die wir im CSF als natürlichem Medium erhielten. Jedoch konnten in, mit CA-MHB-angereichertem, Zellkulturmedium ähnliche MHK-Werte für klinische S. suis Isolate erzielt werden, wie in dem physiologischen Testmedium CSF. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit einer Empfindlichkeitsprüfung von antimikrobiellen Peptiden in einem Medium, das die klinisch relevanten Bedingungen genau imitiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Daten dieser Arbeit neue Erkenntnisse über die Rolle von DNasen, Cathelicidinen und NETs bei der Abwehr von S. suis-Infektionen durch den Wirt liefern. Darum kann diese Arbeit zu einem besseren Verständnis des Wirt- Erreger- Interaktionen während einer S. suis Meningitis beitragen.