Mosquito-borne Flaviviruses: Vector and Avian Host Susceptibility for West Nile Virus and Usutu Virus in Germany
Flaviviruses are known to cause a variety of diseases in humans as well as animals, ranging from mild febrile illnesses to severe hemorrhagic or neuroinvasive manifestations. West Nile virus (WNV) and Usutu virus (USUV) are closely related flaviviruses circulating in an enzootic sylvatic cycle, consisting of mosquitoes (particularly Culex species) as vectors and birds as amplifying and/or reservoir hosts. To date WNV is the most dispersed zoonotic arbovirus, with detections in every continent aside Antarctica. At the same time, USUV is also expanding its geographical range and colonizing new ecological niches. Since the first isolation of USUV (2010) and WNV (2018) in Germany, both viruses have become endemic with annually recorded outbreaks. This has not only emphasized the necessity for evidence-based passive and active surveillance programs, but also for the completion of infection studies focusing on the pathogenesis of these viruses and the immunocompetence of their hosts. The experiments in the frame of this thesis, therefore, began to uncover vector species involved in the WNV and USUV transmission cycles in Germany and to tackle the question of whether domestic poultry could play a role as an amplifying and/or reservoir host for WNV. In the first study (manuscript I) German and Serbian Culex pipiens biotype molestus and German Cx. torrentium species proved to be vector-competent for an USUV Africa lineage 2 strain, isolated in Germany (2015). By contrast, a Malaysian Aedes aegpyti colony could not transmit USUV in its saliva. The second study (manuscript II) comprised vector competence studies with indigenous mosquito species and the first recorded WNV lineage 2 strain from eastern Germany (2018). Two populations of field-derived Cx. pipiens biotype pipiens from the northeast of Germany could readily transmit WNV in their saliva after feeding on an infectious blood meal. The same was true for a German and a Serbian Cx. pipiens biotype molestus colony. The study also confirmed the temperature-dependency of vector competence, as the dissemination rates and transmission efficiencies of Cx. pipiens biotype pipiens were significantly greater at 25 °C and 28 °C compared to only 18 °C. Surprisingly, however, individual mosquitoes were still able to transmit WNV after incubation at 18 °C, an indication for the adaptation of the vector and the virus to temperate climates. An invasive Ae. albopictus population, established in central Germany, was also susceptible to WNV, but did not transmit infectious saliva to the same extent as the Culex species. The third study (manuscript III) aimed to establish a method to successfully infect Culex species via the intrathoracic injection of WNV, this being a prerequisite for the mosquito-to-bird infection model. The intrathoracic injection of both Cx. pipiens biotype pipiens and Cx. torrentium with a European WNV lineage 1 strain guaranteed a disseminated infection with approximately every second mosquito secreting infectious saliva 10/11 days post infection (dpi). Finally, the fourth study (manuscript IV) examined the interactions between susceptible vectors and hosts i.e., domestic poultry. It was designed to mimic the natural mosquito-to-bird transmission pathway of WNV and to compare subsequent disease pathogenesis to that of subcutaneously injected birds. In the first experiments, juvenile chickens, ducks, and geese were injected subcutaneously with a European WNV lineage 1 strain and subsequently sampled for three weeks. The majority of the birds did not develop any clinical signs aside from one duck that succumbed 2 dpi and two geese that possibly developed a persistent infection. In general, the chickens were least susceptible, while the ducks displayed the highest antibody levels and the geese the highest viremia. Viral shedding was observed in all three species from 2 to 5 dpi, and was mainly via the oropharynx in chickens and geese and via the cloaca in ducks. Macroscopic lesions were observed in the ducks and geese (pale and mottled appearance of the myocardium). All three species developed histological lesions, primarily detected in the hearts (myocarditis) and brains (encephalitis) of the ducks and the spleens (hyperplasia/splenitis) and brains (encephalitis) of the geese. As geese were most susceptible to WNV after its subcutaneous injection, this species was also used for the mosquito-to-bird infection model. For this purpose, field-derived Cx. pipiens biotype pipiens mosquitoes from Germany were intrathoracically injected with the WNV lineage 1 strain and allowed to feed on juvenile geese 10 dpi. Four of the eight exposed geese developed viremia, shed virus, seroconverted, and exhibited pathological lesions. The geese infected via mosquito bite displayed higher viremia levels and more diverse pathological lesions than those injected subcutaneously, providing evidence for a mosquito saliva-induced modulation of WNV pathogenesis. In conclusion, even though domestic poultry is unlikely to act as an amplifying or reservoir host for WNV lineage 1, ducks and geese appear to be suitable sentinel species.
Flaviviren verursachen eine Vielzahl von Krankheiten in Menschen und Tieren. Die Bandbreite reicht von fieberhaften, grippeähnlichen Erkrankungen bis hin zu schweren hämorrhagischen und neuroinvasiven Formen. Das West-Nil-Virus (WNV) und das Usutu-Virus (USUV) sind engverwandte Flaviviren, die in einem enzootisch-sylvatischen Zyklus existieren, mit Stechmücken (insbesondere Culex-Arten) als Vektoren und Vögeln als Amplifikations-, beziehungsweise Reservoirwirten. WNV ist heute das am weitesten verbreitete zoonotische Arbovirus und zirkuliert auf allen Kontinenten außer der Antarktis. Zeitgleich erobert auch das USUV stetig neue ökologische Nischen. Beide Viren sind seit dem ersten Nachweis in Deutschland (USUV 2010; WNV 2018) endemisch, mit jährlich wiederkehrenden Ausbrüchen. Dies unterstreicht die Notwendigkeit von evidenzbasierten, aktiven und passiven Überwachungsprogrammen sowie von gezielter Forschung zur Viruspathogenese in empfänglichen Wirten und deren Immunkompetenz. Diese Doktorarbeit befasst sich daher mit der Identifikation von vektorkompetenten Stechmücken für WNV und USUV in Deutschland und der Rolle des Wirtschaftsgeflügels im Übertragungszyklus von WNV. In der ersten Studie (Manuskript I) konnten deutsche sowie auch serbische Culex pipiens Biotyp molestus und deutsche Cx. torrentium Mücken als potentielle USUV-Vektoren bestätigt werden. Sie übertrugen erfolgreich mittels Speichel ein USUV-Afrika 2 Isolat, welches ursprünglich von einem Bartkauz (aus 2015) stammte. Eine malaysische Aedes aegypti Laborkolonie erwies sich hingegen als vermindert empfänglich gegenüber dem Virus. Die zweite Studie (Manuskript II) beinhaltet Vektorkompetenzstudien mit einheimischen Stechmücken und dem ersten deutschen WNV-Linie 2 Isolat (aus 2018). Zwei Cx. pipiens Biotyp pipiens Stechmückenpopulationen, gewonnen aus Eischiffchen aus dem Nordosten Deutschlands, konnten nach Aufnahme einer infektiösen Blutmahlzeit mit ihrem Speichel WNV übertragen. Dies gilt auch für etablierte Cx. pipiens Biotyp molestus Kolonien aus Deutschland und Serbien. Des Weiteren konnte die Temperaturabhängigkeit der Vektorkompetenz von Stechmücken bestätigt werden. Die Disseminationsraten und Transmissionseffizienzen waren bei 25 °C und 28 °C signifikant höher als im Vergleich zu 18 °C. Trotzdem konnten vereinzelte Stechmückenweibchen infektiösen Speichel auch nach einer zwei- bis dreiwöchigen Inkubation bei 18 °C absondern. Dies ist ein Indiz für die Adaptation vom Vektor und vom Virus an das hiesige Klima. Weiterhin erwies sich eine neuetablierte, invasive Ae. albopictus Population aus Mitteldeutschland als weiterer möglicher Überträger von WNV, allerdings nicht in demselben Umfang wie die Culex-Arten. Die dritte Studie (Manuskript III) diente der Etablierung von Infektionsmodellen basierend auf der intrathorakalen Injektion in einheimischen Culex-Arten mit WNV. Dies war ein wichtiger Baustein für die nachfolgende Tierstudie. Die intrathorakale Injektion gewährleistete eine disseminierte WNV-Infektion in Cx. pipiens Biotyp pipiens und Cx. torrentium Stechmückenweibchen, wobei ungefähr jede zweite Mücke nach 10 bis 11 Tagen infektiösen Speichel absonderte. Die letzte Studie (Manuskript IV) befasste sich mit der Etablierung eines Vektor-Wirts-Systems, um ein genaueres Verständnis der Interaktionen zwischen vektorkompetenten Stechmücken und Nutzgeflügelarten zu erarbeiten. Hierfür wurde der natürliche Infektionsweg des Virus über die Stechmücke in den Vogel nachgeahmt und anschließend die Pathogenese mit subkutan infiziertem Wirtschaftsgeflügel verglichen. Im ersten Teil wurden juvenile Hühner, Enten und Gänse mit einem Isolat der europäischen WNV-Linie 1 subkutan infiziert. Anschließend wurden die Vögel drei Wochen lang beprobt. Fast alle Vögel zeigten dem Zeitraum über keinerlei klinische Symptomatik. Lediglich eine Ente verstarb frühzeitig und zwei Gänse entwickelten möglicherweise eine persistente WNV-Infektion. Vergleichsweise zeigten die Hühner die geringste Empfänglichkeit gegenüber WNV, während bei den Enten die stärkste Antikörperreaktion nachgewiesen wurde, sowie bei den Gänsen die stärkste Virämie. Bei allen drei Spezies erfolgte die Virusausscheidung vom zweiten bis zum fünften Tag nach der Infektion. Sie verlief bei den Hühnern und Gänsen vor allem oropharyngeal, bei den Enten vorrangig kloakal. Abgesehen von den Hühnern konnten bei fast allen Vögeln makroskopische Aufhellungen an der Herzmuskulatur nachgewiesen werden. Bei allen drei Spezies deuteten die histologischen Läsionen auf eine virale Infektion hin. Bei den Enten war das Herz (Myokarditis) und das Gehirn (Enzephalitis) am stärksten betroffen und bei den Gänsen sowohl die Milz (Hyperplasie/Splenitis) als auch das Gehirn (Enzephalitis). Da sich die Gänse in diesem ersten Teilversuch am empfänglichsten erwiesen, wurde diese Spezies auch für das Vektor-Wirts-Modell verwendet. Zunächst wurden aus dem Nordosten Deutschlands stammende Cx. pipiens Biotyp pipiens Stechmücken intrathorakal mit WNV infiziert und nach einer Inkubationszeit von zehn Tagen an die Gänse gesetzt. Die Hälfte der exponierten Gänse zeigten eine Virämie, schieden Virus aus, serokonvertierten und entwickelten pathomorphologische Veränderungen. Interessanterweise entwickelten die Gänse nach einer Infektion durch Mückenstiche eine höhere Virämie und eine größere Bandbreite an pathologischen Läsionen als nach subkutaner Injektion mit WNV. Diese Ergebnisse bestätigen die Annahme, dass Mückenspeichel die Viruspathogenese positiv beeinflusst. Die hier beschriebenen Studien zeigen, dass das Nutzgeflügel (Huhn, Ente, Gans) kein Amplifikations-/Reservoirwirt für WNV-Linie 1 darstellt. Trotzdem könnten Enten und Gänse in Freilandhaltung als Sentinel-Spezies genutzt werden.
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