Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Veterinary Glycoimmunology: Generation and in vitro application of a novel sheep C-type lectin receptor fusion protein library

C-type lectins (CTLs) are crucial innate pattern recognition receptors (PRRs) which appear throughout the animal kingdom, from nematodes and insects up to the higher animals and humans. They recognize various host and foreign carbohydrates, as well as further polypeptide and crystal ligands, evoke regulatory signals and participate in phagocytosis and priming of adaptive immune responses against viral, bacterial, fungal and parasitic infections. In the first chapter of this thesis, general concepts regarding the immune system and specifically the role of relevant PRR families, such as the CTLs, Toll-like and NOD-like receptors, are introduced. Following, the state of research concerning CTLs in veterinary medicine is summarized. Though barely nascent, veterinary glycoimmunology already presents most promising concepts and methods, featuring the role of CTLs in controlling autoimmunity, host-pathogen interactions, and cancer. The detrimental effects of CTLs, such as their causative role in allergies and the immune compromising aspect of several CTLs posing as pathogen adhesion molecules, are also reviewed. Current problems and limitations of veterinary CTLrelated research are discussed. Specifically, the limited applicability of mouse models in research on veterinary species, and deficits in species-specific characterization of CTL ligand preferences and the respective CTL-mediated signaling are addressed. A novel sheep CTL fusion protein library providing a means to study sheep CTL/ligand interactions in vitro is introduced in the second chapter. It is comprised of eight distinct recombinant CTLs, all of which were produced in suspended Chinese hamster ovary (CHO) cells, expressed as homodimers fused to the human immunoglobulin G1 fragment of crystallization (IgG1 Fc). The functionality of the sheep CTL hFc-fusion protein library was verified with known ligands of corresponding mouse CTL orthologues in ELISA- and flow cytometry-based binding studies. The obtained results indicate that similar (Dectin-1, Dectin-2, Mincle, DNGR-1) as well as differing (Langerin) ligand preferences of orthologous sheep and mouse CTLs exist. Ensuing, the ovine CTL hFc-fusion protein library was applied in a proof-of-principle flow cytometry-based pathogen screening study with the model ruminant pathogen Mycoplasma mycoides subsp. capri. Thereby, novel interactions of several sheep CTLs, such as MCL, MICL, and DCIR, were identified. In addition, an Aedes aegypti mosquito CTL hFc-fusion protein library was generated for collaborative studies on zoonotic arboviruses, such as the Rift Valley Fever virus. Finally, the generation of ovine CTL-expressing reporter cells was initiated to investigate the signal transducing potential of the respective CTL/ligand interactions. Results obtained with ovine follicle stimulating hormone isoform 3 (FSHR3) and derivative sheep Dectin-1 FSHR3 hybrid receptor reporter cell are, however, yet preliminary and require further studies.

C-Typ Lektine (CTLs) sind wichtige Mustererkennungs-Rezeptoren (“pattern recognition receptors”, PRRs) auf Zellen des angeborenen Immunsystems. Sie kommen bei verschiedensten Vertretern des Tierreiches, von Nematoden über Insekten bis zu den höheren Tieren und dem Menschen, vor. Zu ihren Funktionen gehört die Erkennung von verschiedenen körpereigenen und körperfremden Kohlenhydraten sowie von weiteren Polypeptid- und Kristallliganden. In diesem Zusammenhang lösen sie regulatorische Signalkaskaden aus und beteiligen sich an der Phagozytose und der anschließenden Prägung („priming“) der adaptiven Immunität im Kampf gegen virale, bakterielle, mykotische und parasitäre Infektionen. Im ersten Kapitel dieser Arbeit werden allgemeine Konzepte zum Immunsystem und insbesondere zur Rolle der bekanntesten PRR-Familien wie z.B. den CTLs, Toll-like- und NOD-like-Rezeptoren, vorgestellt. Im Folgenden wird der Forschungsstand zu CTLs in der Veterinärmedizin zusammengefasst. Obwohl erst im Entstehen begriffen, weist die VeterinärGlykoimmunologie bereits jetzt vielversprechende Konzepte und Methoden auf, welche die Rolle von CTLs bei der Kontrolle von Autoimmunreaktionen, den Wechselwirkungen zwischen Wirt und Krankheitserreger und der Prävention von Krebs thematisieren. Die nachteiligen Wirkungen von manchen CTLs, wie beispielsweise eine Beteiligung an der Entstehung von Allergien und die Rolle von einigen CTLs als Pathogenadhäsionsmoleküle, werden ebenfalls besprochen. Daneben werden aktuelle Probleme und Limitationen der veterinärmedizinischen CTL-bezogenen Forschung ebenfalls diskutiert. Insbesondere werden die eingeschränkte Anwendbarkeit von Mausmodellen bei der Erforschung veterinärmedizinischer Spezies sowie die Defizite bei der artspezifischen Charakterisierung der CTL-Ligandenpräferenzen und der jeweiligen CTL-vermittelten Signalübertragung thematisiert. Im zweiten Kapitel wird eine neue CTL-Fusionsproteinbibliothek aus Schaf vorgestellt, mit der CTL-Ligand-Interaktionen von Schaf-CTLs in vitro untersucht werden können. Sie besteht aus acht verschiedenen CTLs. Alle Fusionsproteine wurden in Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) als Homodimere, fusioniert mit dem Fc-fragment des menschlichen Immunglobulin G1 (IgG1 Fc), hergestellt. Deutsche Zusammenfassung 4 Die Funktionalität der Bibliothek wurde in ELISA- und Durchflusszytometrie-basierten Bindungsstudien mit entsprechenden Maus-CTL-Orthologen verglichen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass sowohl vergleichbare (Dectin-1, Dectin-2, Mincle, DNGR-1) als auch unterschiedliche (Langerin) Ligandenpräferenzen von orthologen Schaf- und Maus-CTLs existieren. Anschließend wurde die CTL-hFc-Fusionsproteinbibliothek aus Schaf in einer Durchflusszytometrie-basierten Pathogen-Bindungs-Studie mit dem Modell-WiederkäuerPathogen Mycoplasma mycoides subsp. capri getestet. Dabei wurden neue Interaktionen mehrerer Schaf-CTLs wie MCL, MICL und DCIR gefunden. Zudem wurde eine CTL-hFcFusionsproteinbibliothek aus der Aedes aegypti Mücke für gemeinsame Studien zu zoonotischen Arboviren wie dem Rift Valley Fever-Virus erstellt. Zum Schlusss wurden erste Arbeiten an CTL-exprimierenden Reporterzellen von Schafen durchgeführt, die zu Untersuchungen der Signaltransduktion der jeweiligen CTLLigandenbindungen genutzt werden sollen. Die Ergebnisse, die mit dem ovinen Follikelstimulierenden Hormon Isoform 3 (FSHR3) und dem davon abgeleiteten ovinen Dectin-1- FSHR3-Hybridrezeptor erhalten wurden, sind jedoch noch präliminär und erfordern weitere grundlegende Anpassungen.

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