Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Entwicklung und Einsatz eines Tränkewasserzusatzes aus organischen Säuren als Campylobacter-Minimierungsstrategie in der Geflügelmast und Untersuchungen zur bakteriellen Adaptation

Angesichts der konstant hohen Infektionszahlen mit Campylobacter spp. beim Menschen sind wirksame Minimierungsstrategien dringend notwendig. Organische Säuren als Interventionsmaßnahme bieten die Möglichkeit, auf verschiedenen Stufen der Lebensmittelproduktion zur Bekämpfung von Campylobacter spp. eingesetzt werden zu können. Die vorliegende Arbeit zielte darauf ab, in einem systematischen Ansatz in vitro einen Tränkewasserzusatz, bestehend aus einer optimalen Kombination von organischen Säuren, zu entwickeln und den reduzierenden Effekt dieser Säurekombination auf die Campylobacter spp.-Konzentration im Darm von Masthähnchen zu untersuchen. Zudem sollte sowohl in vitro als auch in vivo untersucht werden, ob Campylobacter spp. die Fähigkeit besitzen, sich an organische Säuren zu adaptieren und folglich reduzierte Empfindlichkeiten zu zeigen. Zur Entwicklung eines effektiven Tränkewasserzusatzes wurde die antibakterielle Wirksamkeit von zehn organischen Säuren gegenüber Campylobacter spp. untersucht. Dazu wurde die minimale Hemmkonzenzentration (MHK-Wert) der organischen Säuren gegenüber 20 C. jejuni- und 10 C. coli-Stämmen mittels der Bouillon-Mikrodilutionsmethode ermittelt. Basierend auf diesen Ergebnissen und weiteren Faktoren wurden insgesamt zehn Säurekombinationen aus drei bis fünf organischen Säuren zusammengestellt und auf ihre antibakterielle Wirksamkeit getestet. Die MHK-Werte der organischen Säuren von neun der zehn Säurekombinationen waren erniedrigt im Vergleich zu den MHK-Werten der einzelnen organischen Säuren. Darüber hinaus konnten für neun von zehn Säurekombinationen synergistische Aktivitäten gegenüber mindestens zwei Campylobacter spp.-Isolaten nachgewiesen werden. Eine Kombination aus Sorbinsäure, Benzoesäure, Propionsäure und Essigsäure wurde für den Einsatz im Hähnchen-Tiermodell ausgewählt, da diese Kombination niedrige MHK-Werte der Einzelkomponenten aufwies, synergistische Interaktionen gegenüber einer größeren Anzahl an Campylobacter spp.-Isolaten zeigte und ausschließlich aus organischen Säuren besteht, die bereits als Futtermittelzusatzstoff in der Europäischen Union zugelassen sind. Die Säurekombination wurde dem Tränkewasser über die gesamte Mastperiode hinweg in einer Gesamtkonzentration von 16 mmol/L zugesetzt und bewirkte eine pH-Wert Absenkung des Wassers auf pH 6,0. Die Endkonzentration der organischen Säuren in Kombination entsprach jeweils dem 4-fachen des MHK-Werts der einzeln getesteten organischen Säuren gegenüber dem inokulierten C. jejuni-Stamm. Die Versuchsgruppe zeigte vom 3. bis zum 18. Tag nach der Inokulation signifikant niedrigere über den Kot ausgeschiedene Campylobacter-Konzentrationen als die Kontrollgruppe. Die mittels Kloakentupfer bestimmten Campylobacter-Konzentrationen waren dabei signifikant um bis zu 2 Log10-Stufen reduziert. Die Sektion der Tiere erfolgte 23 Tage nach der Inokulation. In den in der Sektion entnommenen Zäkum- und Kolonproben konnte keine Reduktion der Campylobacter-Konzentrationen beobachtet werden. Untersuchungen zur Adaptationsfähigkeit von Camypylobacter spp. gegenüber organischen Säuren zeigten für zwei C. jejuni- und ein C. coli-Feldisolat, dass sie sich in vitro an Sorbinsäure bzw. Propionsäure adaptieren können. Die drei Isolate wurden auf Blutplatten supplementiert mit unterschiedlichen Konzentrationen einer der beiden organischen Säuren schrittweise an höhere Konzentrationen adaptiert. Die adaptierten Isolate zeigten zwei- bis vierfach erhöhte MHK-Werte im Vergleich zu den Ursprungsisolaten. Um zu untersuchen, welche Auswirkung das Auftreten von adaptierten Isolaten in einer Campylobacter spp.-Population haben könnte, wurden Kompetitionsversuche durchgeführt, in denen das Wachstumsverhalten der adaptierten Isolate und der Ursprungsisolate in direkter Konkurrenz untersucht wurde. Die adaptierten Isolate zeigten signifikant erniedrigte Anteile an der Bakterienpopulation und wurden von den Ursprungsisolaten verdrängt. Die Ergebnisse deuten auf einen Fitnessverlust der adaptierten Isolate hin. Weiterführende Untersuchungen zum Wachstumsverhalten der Isolate in Reinkultur zeigten signifikant längere Lag-Phasen für die adaptierten Isolate im Vergleich zu ihren Ursprungsisolaten. Die Entwicklung einer an die Säurekombination adaptierten C. jejuni-Population stellt einen möglichen Grund dafür dar, dass die Applikation der organischen Säuren keinen reduzierenden Effekt auf die C. jejuni-Konzentrationen im Zäkum der Masthähnchen aufwies. Um dies zu untersuchen, wurden insgesamt 90 Campylobacter-Kolonien zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Tierversuchs aus Kloakentupferproben und dem Zäkum isoliert und die MHK-Werte bestimmt. Alle Re-Isolate zeigten die gleichen MHK-Werte wie der Teststamm. Damit konnte in vivo keine Adaptation des C. jejuni-Stamms beobachtet werden. Es ist bekannt, dass sowohl die Campylobacter spp.-Besiedlung im Hähnchendarm als auch die externe Kontamination der Tiere, die durch fäkale Ausscheidungen verursacht wird, mögliche Kontaminationsquellen für die Karkassen während der Schlachtung darstellen. Durch die reduzierte fäkale Ausscheidung des Bakteriums und folglich einer reduzierten externen Kontamination der Broiler könnte die Anwendung von organischen Säuren dazu beitragen, die Campylobacter spp.-Last in der Lebensmittelkette zu senken.

Considering the constant high number of reported cases of Campylobacteriosis, effective mitigation strategies are urgently needed to reduce human infection rates. The use of organic acids provides the opportunity of a wide range of applications targeting different stages of the food chain. The aim of the present study was to systematically develop a drinking water additive consisting of an optimized combination of organic acids and to evaluate the in vivo antibacterial effect of this combination against Campylobacter spp. colonization in broilers. Furthermore, adaptation responses in Campylobacter spp. to organic acids were investigated both in vitro and in vivo. For developing an optimized combination of organic acids, susceptibility testing of 20 C. jejuni and ten C. coli isolates against ten organic acids was performed. The minimal inhibitory concentration (MIC) values of the Campylobacter spp. isolates were determined using the broth microdilution method. According to different factors including the obtained MIC values, ten combinations consisting of three to five organic acids were developed and tested for their antibacterial efficacy against the Campylobacter spp. isolates. For nine of ten combinations, combining organic acids decreased the MIC values of each organic acid. Furthermore, it was shown for nine of ten combinations to exhibit synergistic interactions against two or more Campylobacter spp. isolates. Based on the results of the in vitro study, a combination of sorbic acid, benzoic acid, propionic acid and acetic acid was selected for the in vivo study. For this combination, susceptibility testing of the selected organic acids showed not only low MIC values, but revealed synergistic activities in reducing growth of a relatively large number of Campylobacter spp. isolates. In addition, the selected combination consisted exclusively of organic acids listed as authorized feed additives in the European Union. The combination of organic acids was applicated via drinking water at a final concentration of 16 mmol/L during the entire rearing period. Addition of the organic acids acidified the water to pH 6.0. Organic acids were administered at concentrations 4-fold higher than the MIC values determined for the inoculated C. jejuni strain. Cloacal swabs of the treatment group indicated significant lower C. jejuni concentrations compared to the control group from eight to 18 days post inoculation. The C. jejuni counts were reduced by up to 2 log10 most probable numbers (MPN)/g. However, after necropsy at the end of the trial (23 days post inoculation), C. jejuni counts in cecum and colon of the treatment group were similar to the control group. In vitro adaptation experiments demonstrated for two C. jejuni and one C. coli field isolates the ability to adapt to sorbic acid or propionic acid. For the experiments, isolates were successively sub-cultured on blood agar plates supplemented with increasing concentrations of the organic acids. Susceptibility testing revealed that the adapted isolates yielded 2- to 4-fold higher MIC values than their wild-type isolates. Growth competition experiments were performed to estimate the competitive ability of adapted variants in a bacterial population. For this, adapted isolates and their respective wildtype isolates were co-cultured together. All adapted isolates showed decreased proportions compared to their wild-type isolates in the bacterial population. Results indicate that the adaptation was associated with a fitness cost. Further investigation of growth kinetics in single cultures revealed significantly longer lag-phases for adapted isolates compared to their wild-type isolates. One possible for the missing efficacy of the drinking water additive on cecal C. jejuni counts was that the strain adapted to the applicated organic acids, leading to the arise of an organic acid tolerant bacterial population. In order to investigate this, 90 re-isolates from cloacal swabs and cecal samples were collected at three different time points of the trial and tested for their susceptibility. All re-isolates yielded the same MIC value as the inoculated C. jejuni strain. Thus, no adaptation responses in C. jejuni were observed during the in vivo trial. Both, intestinal colonization and external contamination of broilers by feces have been demonstrated in previous studies to lead to contamination of broiler carcasses during slaughter. Thus, application of the combination of organic acids in primary production might contribute to reduced entry of Campylobacter spp. in the food chain by lowering the external contamination.

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