Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Hypothermic storage of boar spermatozoa : a pathway to antibiotic-free liquid semen preservation

An antibiotic (AB)-free, hypothermic (5 °C) storage concept for boar semen was tested in vitro and in vivo, aiming to eliminate routinely supplemented ABs in semen extenders and thus, counteracting the formation of multiresistant bacteria. For semen extended in Beltsville Thawing Solution (BTS) and Androstar Premium (APrem), sublethal chilling injury was assessed for sperm stored at 5 °C compared to storage at 17 °C with AB (control) using two multicolor flow cytometry assays with four fluorochromes each. In addition, bacterial growth and fertility outcome were evaluated. Hypothermic storage induced a loss of viable (Yo-Pro 1 negative) sperm with intact acrosomes (PNA negative) and low membrane fluidity (M540 negative). At 144 h of storage, this sperm subpopulation did not differ between 5 °C and 17 °C, regardless of the extender used. Storage at 5 °C in BTS but not in APrem resulted in a smaller population of viable sperm (Hoechst 333258 negative) with low cytosolic calcium (Calbryte 630 negative) and high mitochondrial membrane potential (JC-1 aggregate positive). After 60 min incubation in capacitation medium, the size of this population was no longer affected by hypothermic storage regardless of the extender used. Computational flow cytometry with t-SNE maps and radar plots revealed similar sperm populations as visualized in three-dimensional stacked bar charts. Bacterial growth was inhibited (<1000 CFU/mL) in semen stored AB-free at 5 °C and, in contrast to semen stored at 17°C with AB, the natural diversity of the bacterial spectrum was maintained. In vivo fertility (n = 194 sows) was equally high for semen stored in APrem at 5°C without AB compared to the 17°C controls with AB. In conclusion, a protective extender and a slow cooling allows AB-free, hypothermic semen storage with high sperm viability, minor sublethal chilling injury, efficient bacteriostasis and high fertility.

Antibiotika (AB)-freie, hypotherme Lagerung (5 °C) von Ebersperma wurde in vitro und in vivo getestet, um den gängigen Zusatz von AB in Verdünnern zu eliminieren und der Bildung von Resistenzen entgegenzuwirken. Sperma wurde in Beltsville Thawing Solution (BTS) und Androstar Premium (APrem) verdünnt und Einflüsse einer Lagerung bei 5 °C und 17 °C (Kontrolle mit AB) auf die Spermaqualität verglichen. Zur Diagnostik subletaler Kälteschäden wurden zwei Mehrfarben-Durchflusszytometrie Assays mit je vier Farbstoffen verwendet und zudem Bakterienwachstum und Fertilitätsergebnisse analysiert. Hypotherme Lagerung führte zum Verlust von lebenden (Yo-Pro-1 negativ) Spermien mit intaktem Akrosom (PNA negativ) und niedriger Membranfluidität (M540 negativ). Nach 144 h unterschied sich diese Subpopulation nicht mehr zwischen 5 °C und 17 °C. Lagerung bei 5 °C in BTS, aber nicht in APrem, führte zu einer kleineren Population lebender (Hoechst 33258) Spermien mit niedrigem zytosolischen Kalzium (Calbryte 630) und hohem Mitochondrienmembranpotential (JC-1 Aggregat positiv). Nach 60 min Inkubation im Kapazitationsmedium war diese Population in beiden Verdünnern gleich groß und nicht mehr von der hypothermen Lagerung beeinflusst. Computerbasierte Durchflusszytometrie mit t-SNE Grafiken und Radar Plots zeigte ähnliche Populationen auf wie dreidimensionale Balkendiagramme. In AB-freiem, 5 °C gelagerten Sperma wurde das Bakterienwachstum inhibiert (<1000 KBE/mL). Darüber hinaus wurde, im Gegensatz zu den 17 °C-Kontrollen mit AB, die natürliche Diversität des Bakterienspektrums erhalten. In APrem verdünntes Sperma ergab eine gleich hohe Fertilität (n=194 Sauen) für 5 °C-Lagerung ohne AB und Kontrolle. Schlussfolgernd ermöglicht ein protektiver Verdünner mit langsamer Abkühlung eine AB-freie, hypotherme Konservierung von Ebersperma mit Aufrechterhaltung einer hohen Lebensfähigkeit der Spermien, geringen subletalen Kälteschäden, effektiver Bakteriostase und hohen Fertilitätsergebnissen.

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