Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Experimentelle Beeinflussung von Virus-induzierten Rückenmarksläsionen bei der Maus als Modell für demyelinisierende Erkrankungen

Hansmann, Florian Heinrich

Demyelinisierende Erkrankungen im zentralen Nervensystem treten sowohl bei Tieren als auch bei Menschen auf. Die Untersuchung der Pathogenese dieser Erkrankungen beim Menschen ist häufig limitiert, da kein geeignetes Probenmaterial aus Verlaufsuntersuchungen zur Verfügung steht. Deshalb werden regelmäßig Tiermodelle wie die experimentelle, murine Theilervirus-Enzephalomyelitis (TME) verwendet, um Teilaspekte von humanen Erkrankungen zu untersuchen. Ziel der vorliegenden Arbeiten war es, die Gemeinsamkeiten und Unterschiede hinsichtlich der Rückenmarkspathologie bei Patienten mit progredienter Multipler Sklerose (MS) und Mäusen während der demyelinisierenden Phase der TME herauszuarbeiten. Weiterhin wurde der Einfluss unterschiedlicher Faktoren wie der Depletion von Astrozyten, dem Fehlen von Matrix-Metalloproteinase 12 (MMP12) und der Transplantation von mesenchymalen Stammzellen (MSC) auf den Verlauf der TME klinisch und morphologisch untersucht. Darüber hinaus wurde ein intraspinales Infektionsmodell entwickelt und in diesem sowohl die Rückenmarkspathologie als auch die peripheren Nervenschäden untersucht. Wesentliche Gemeinsamkeiten zwischen den progredienten Formen der MS und der demyelinisierenden Phase der TME bestehen in einer progressiven, klinischen Verschlechterung der Patienten und Tiere. Hinsichtlich der Rückenmarkspathologie treten bei beiden Erkrankungen ein zunehmender Axonverlust, eine Rückenmarksatrophie sowie eine Demyelinisierung auf. Der Schwerpunkt der Demyelinisierung im Rückenmark bei den MS-Patienten lag in der grauen Substanz während bei der TME überwiegend die weiße Substanz betroffen war. Darüber hinaus stellt die Entzündung im Rückenmark einen wesentlichen Bestandteil für die Pathogenese der Demyelinisierung bei der TME dar, während in der zum Vergleich herangezogenen MS Studie entzündliche Veränderungen im Rückenmark aufgrund ihres chronisch-inaktiven Charakters eine untergeordnete Rolle spielten. Inwiefern und zu welchem Zeitpunkt die Entzündung einen wesentlichen Bestandteil für die Entstehung von Rückenmarksläsionen bei MS darstellt, muss im Rahmen weiterer Studien ermittelt werden. Im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen wurde ein intraspinales TMEV Infektionsmodell entwickelt und genutzt, um die Pathogenese von demyelinisierenden Rückenmarksveränderungen sowie peripheren Nervenschäden zu untersuchen. Sowohl SJL als auch C57BL/6 Mäuse zeigten nach der intraspinalen Infektion eine klinische Verschlechterung einhergehend mit entzündlichen und demyelinisierenden Veränderungen im Rückenmark sowie einem Axonschaden. Die Zeitdauer bis zum Auftreten von klinischen Veränderungen nach intraspinaler Infektion verkürzte sich um ca. 12 Wochen und die Zeitdauer bis zum Auftreten von entzündlichen Veränderungen im Rückenmark um ca. 6 Wochen im Vergleich zur intrazerebralen Infektion von SJL Mäusen. Darüber hinaus wiesen die intraspinal infizierten Tiere eine periphere Neuropathie auf. Bei den intraspinal infizierten SJL Mäusen wurde regelmäßig, bei den C57BL/6 Mäusen nur sehr selten TMEV Protein in den peripheren Nerven nachgewiesen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass nach intraspinaler TMEV-Infektion sowohl empfängliche als auch resistente Mausstämme zur Untersuchung von demyelinisierenden Rückenmarksläsionen verwendet werden können. Darüber hinaus bietet das intraspinale Infektionsmodell die Möglichkeit, die Pathogenese von peripheren Neuropathien, ähnlich dem Guillain-Barré Syndrom, zu untersuchen. Die in vivo Charakterisierung von MSC ergab, dass kanine, murine und humane MSC nach intraventrikulärer Applikation dreidimensionale Zell-Cluster im Ventrikelsystem von Mäusen bilden. Die transplantierten MSC besaßen eine begrenzte Lebensdauer und wiesen kein neoplastisches Wachstum auf. Die begrenzte Lebensdauer der MSC war unter anderem auf eine von T Lymphozyten dominierte Transplantatabstoßungsreaktion zurückzuführen. Hinsichtlich des Einflusses von transplantierten MSC auf den klinischen Verlauf sowie die Rückenmarkspathologie bei der TME zeigte sich, dass die intravenöse, xenogene Transplantation von kaninen MSC zu einer klinischen Verschlechterung einhergehend mit einer vermehrten Entzündung und Demyelinisierung im Rückenmark führt. Intraventrikulär applizierte MSC hatten keinen signifikanten Einfluss auf den klinischen Verlauf der TME, sie führten jedoch zu einer Verminderung des Axonschadens im Rückenmark. Weiterhin wiesen die intravenös transplantierten Tiere follikuläre Lymphozytenaggregate in der Lunge auf. Dieser Befund spricht dafür, dass die Lunge wahrscheinlich eine wichtige Lokalisation für das Priming von T Lymphozyten, vor ihrer Einwanderung in das ZNS, bei der TME darstellt. Eine Astrogliose tritt häufig bei entzündlichen und demyelinisierenden Erkrankungen des ZNS auf. Um die Bedeutung von Astrozyten bei der Pathogenese der TME zu untersuchen, wurde bei TMEV infizierten SJL Mäusen eine Astrozytendepletion durchgeführt. Die Astrozyten-depletierten Mäuse zeigten eine verminderte Entzündungsreaktion sowie eine geringere Anzahl an TMEV positiven Zellen im Rückenmark. Diese Befunde hatten keinen Einfluss auf das Ausmaß der axonalen Schädigung sowie den Grad der Demyelinisierung. Interessanterweise zeigten die Tiere eine signifikante Verschlechterung der Klinik einhergehend mit einer Herunterregulation und dysorganisierten Expression von Aquaporin 4 (AQP4) in den perivaskulären Astrozyten im Rückenmark. Die verminderte und dysorganisierte Expression von AQP4 war wahrscheinlich für eine Veränderung der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix verantwortlich und führte dadurch direkt oder indirekt zu der klinischen Verschlechterung der Tiere. Darüber hinaus wurde der Einfluss des Fehlens von MMP12 (MMP12 knockout) auf die Entwicklung einer Astrogliose, die Anzahl der ins ZNS infiltrierenden Makrophagen sowie auf den Phänotyp von Mikroglia und Makrophagen während der TME untersucht. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass das Fehlen von MMP12 zu einer Verminderung der Astrozytendichte im Rückenmark während der TME führt. Infolgedessen fand eine verminderte Aktivierung, Migration und Proliferation von Mikroglia im Rückenmark statt, was eine verminderte Demyelinisierung zur Folge hatte. Weiterhin kam es durch das Fehlen von MMP12 zu einer Verminderung der Anzahl an Mikroglia, die in den proinflammatorischen M1 Typ differenzieren. Hieraus ergibt sich, dass MMP12 einen Einfluss auf die Astrozytenproliferation hat und eine wesentliche Rolle bei der Mikroglia Aktivierung, Polarisierung und Migration spielt. Die Ergebnisse dieser Arbeit leisten einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der Pathogenese von demyelinisierenden Erkrankungen. Die neuen Erkenntnisse hinsichtlich der Funktion von Astrozyten und ihrer Interaktion mit Mikroglia stellen eine Grundlage für die Entwicklung von zukünftigen Therapiestrategien dar.

Demyelinating diseases occur in the central nervous system (CNS) of humans and animals. The investigation of the pathogenesis of human demyelinating diseases is often limited, since no suitable sample material from follow-up examinations is available. Therefore, animal models such as Theiler’s murine encephalomyelitis (TME) are frequently used for studying aspects of the pathogenesis of human diseases. As part of this work, similarities and differences regarding spinal cord pathology in progressive multiple sclerosis (MS) and the demyelinating phase of TME were investigated. Subsequently, the impact of various factors such as the depletion of astrocytes, absence of matrix metalloproteinase 12 (MMP12) as well as the transplantation of mesenchymal stem cells (MSC) upon the course of TME were clinically and morphologically examined. In addition, an intraspinal infection model was established in which spinal cord pathology as well as peripheral nerve damage were investigated. Similarities between the progressive forms of MS and the demyelinating phase of TME consist of progressive clinical deterioration of patients and animals, respectively. Spinal cord pathology in MS and TME includes progressive axon loss, atrophy of the spinal cord and demyelination. Demyelination in the spinal cord in MS was primarily located in the gray matter, while in TME the white matter was predominantly affected. In addition, inflammation in the spinal cord is essential for the occurrence of demyelination in TME, while inflammatory changes in the spinal cords of MS patients from the included study did not play a role due to the chronic inactive lesion character. However, the extent and time points, at which inflammation is crucial for the development of spinal cord lesions in MS has to be determined in further studies. As part of this work an intraspinal TMEV infection model was established and used for investigating the pathogenesis of demyelinating spinal cord lesions and peripheral nerve damage. Both, SJL and C57BL/6 mice showed a clinical deterioration after intraspinal infection, along with inflammatory and demyelinating spinal cord lesions as well as axonal damage. After intraspinal infection, onset of clinical signs was approximately 12 weeks earlier and the time span to onset of spinal cord inflammation was approximately 6 weeks shorter compared to intracerebral infection of SJL mice. In addition, intraspinally infected animals showed a peripheral neuropathy. After intraspinal infection, SJL mice showed frequently and C57BL/6 mice very rarely TMEV protein in the peripheral nerves. The results of these studies demonstrate, that susceptible and resistant mouse strains can be used for studying TMEV induced, demyelinating spinal cord lesions after intraspinal infection. In addition, the intraspinal infection model offers the possibility to investigate the pathogenesis of peripheral neuropathies, like Guillain-Barré syndrome. In vivo characterization of MSC revealed that canine, murine and human MSC form three-dimensional cell clusters in the ventricular system of mice after intraventricular application. Transplanted MSCs had a limited lifespan and showed no neoplastic growth. The limited lifespan of the MSC was in part due to a T lymphocyte mediated, anti-graft immune response. In TME, intravenously transplanted canine MSC caused a deterioration of clinical signs accompanied by increased inflammation and demyelination in the spinal cord. Intraventricularly administered MSC had no significant impact upon the clinical course of TME, however, they caused a reduction of axonal damage in the spinal cord. Intravenously transplanted animals also showed follicular aggregates of lymphocytes in the lungs. This finding indicates, that the lung is likely to be an important priming site for T lymphocytes before they enter the CNS in TME. Astrogliosis often occurs in inflammatory and demyelinating diseases of the CNS. In order to investigate the importance of astrocytes in the pathogenesis of TME, astrocyte depletion was carried out in TMEV infected SJL mice. Astrocyte-depleted mice showed a reduced degree of inflammation and lower numbers of TMEV positive cells in the spinal cord. These findings had no impact on the extent of axonal damage or the degree of demyelination. Interestingly, astrocyte-depleted animals showed a significant deterioration of clinical signs, accompanied by a downregulation and disorganized expression of aquaporin 4 (AQP4) in perivascular astrocytes in the spinal cord. The reduced and disorganized expression of AQP4 probably caused a change in the composition of the extracellular matrix and thereby directly or indirectly contributed to the clinical deterioration of the animals. In addition, the influence of the absence of MMP12 (MMP12 knockout) on the development of astrogliosis, the number of macrophages infiltrating into the CNS and on the phenotype of microglia and macrophages during TME was investigated. This study demonstrated, that the lack of MMP12 leads to a reduction of the astrocyte density during TME. As a result, activation, migration and proliferation of microglia in the spinal cord was decreased, which caused a reduction of demyelination. Furthermore, the lack of MMP12 was associated with a reduced number of microglia differentiating into the pro-inflammatory M1 type. This leads to the conclusion that MMP12 influences astrocyte proliferation and plays an important role in microglia activation, polarization and migration. The results of this work significantly contribute to the understanding of the pathogenesis of demyelinating diseases. The new findings regarding the functions of astrocytes and their interactions with microglia form a basis for the development of future therapy strategies.

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Hansmann, F.H., 2020. Experimentelle Beeinflussung von Virus-induzierten Rückenmarksläsionen bei der Maus als Modell für demyelinisierende Erkrankungen. DVG Service, Gießen.
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