Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Entwicklung eines epithelzellbasierten Bioassays zum frühen indirekten Trächtigkeitsnachweis beim Rind

Bentrup, Ann-Kathrin Maria GND

Trotz hoher Befruchtungsraten (ca. 90 %) bei Milchkühen liegt die Abkalberate jedoch nur bei etwa 40–55 %. Das Hauptproblem, welches zum Auftreten der frühen embryonalen Mortalität führt, ist die Trächtigkeitserkennung, die beim Rind über das Interferon-τ (IFNτ) gesteuert wird. Die Wirkungen von IFNτ werden über die Expression von Interferon-stimulierten Genen (ISG) vermittelt. Das Ziel dieser Arbeit war es das Trächtigkeitssignal von tragenden Kühen, an Tag 16 p.i., mittels indirektem zellbasiertem Assay zu detektieren. Es wurden drei verschiedene bovine epitheliale Zelllinien (Trophoblasten (F3), Karunkelepithel (BCEC), Nierenepithel (MDBK) über 24 Stunden mit verschiedenen Stimulationslösungen (z.B. zusätzliche Konzentrationen von rbIFNτ, Progesteron und gepoolte Serumproben von tragenden und nicht-tragenden Kühen von Tag 1 und 16 p.i) kultiviert. Im Anschluss wurde die mRNA aus den Zellen extrahiert und die Konzentration der ISG mRNA von ISG15 und MX2 per qRT-PCR gemessen. Es konnte gezeigt werden, dass alle verwendeten Zelllinien in der Lage waren konzentrationsabhängig auf zugegebenes rbIFNτ mit einer Veränderung der mRNA-Konzentration von ISG15 und MX2 zu reagieren. In den drei verschiedenen Zelltypen war die Zielgenexpression nach der Stimulation mit Serum von tragenden und nicht-tragenden Kühen (Tag 16 p.i.) vergleichbar. In der Transkriptomanalyse wurden über 1200 unterschiedlich exprimierte Gene aufgezeichnet. Nach Analyse der Ergebnisse verblieben noch 12 Gene, diese wurden nur exprimiert in den Vergleichskombinationen mit Serum der tragenden Tiere Tag 16 p.i. Von diesen Genen wurde die 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase 2 (HSD17B2) für die Messung der mRNA in den MDBK ausgewählt. Hier zeigte sich keine Veränderung der mRNA-Konzentration nach Stimulation der MDBK mit verschiedenen Konzentrationen von rbIFNτ oder Progesteron. Signifikante Unterschiede in der HSD17B2 mRNA-Konzentration zeigten sich nach der Stimulation mit Serumproben von tragenden und nicht-tragenden Kühen. Es zeigte sich eine verminderte Genexpression zwischen den tragend Tag 1 Proben und den Proben von tragend Tag 16 auf (p < 0,05), sowie zwischen den Gruppen nicht-tragend 16 und tragend 16 (p < 0,01). Die HSD17B2 reagiert IFNτ-unabhängig auf Serumproben von tragenden und nicht-tragenden Kühen (Tag 16 p.i.). Erniedrigte HSD17B2 mRNA-Konzentrationen konnten mit einer Trächtigkeit assoziiert werden. Diese Ergebnisse bieten vielversprechende Ansätze für die weitere Entwicklung des frühen indirekten Trächtigkeitsnachweises beim Rind.

Despite high positive fertilization rates (about 90 %) in dairy cows, the calving rate is low (40–55 %). The most important pregnancy recognition signal is Interferon-τ (IFNτ). The effects of IFNτ at e.g. the endometrium are mediated by the expression of interferon-stimulated genes (ISG). The aim of this study is to develop an indirect test system for detection of the bovine gestation signal and with that a very early pregnancy diagnosis. Three different bovine epithelial cell lines (trophoblast cells (F3), caruncular epithelial cells (BCEC), kidney cells (MDBK)) were cultivated over 24 hours with different stimulation solutions (e.g. additional concentrations of recombinant IFNτ (rbIFNτ), progesterone, and pooled serum samples from pregnant and non-pregnant cows from day 1 and 16 p.i). After the stimulation mRNA was extracted, followed by c-DNA synthesis and determination of mRNA expression of ISG15 and MX2 via qRT-PCR.All three cell lines were able to react to added rbIFNτ in different concentrations with a change in mRNA expression of ISG15 and MX2. The higher the added concentration rbIFNτ, the higher the ISG expression. The stimulation of the epithelial cell lines with serum of pregnant and non-pregnant cows had no significant effect on the ISG mRNA expression (ISG15 and MX2). The transcriptome analysis recorded more than 1200 differently expressed genes. 12 genes were only expressed due to the stimulation of the MDBK with serum samples of the pregnant cows day 16 p.i. Of these genes, the 17β-hydroxysteroid dehydrogenase 2 (HSD17B2) was selected for the measurement of mRNA expression in the MDBK. No change in the mRNA expression was shown to the stimulation of MDBK with different concentrations of rbIFNτ or progesterone. But significant differences in HSD17B2 mRNA expression were shown after stimulation with serum samples of pregnant and non-pregnant cows. There was a decrease in gene expression between the pregnant day 1 samples and the samples of pregnant day 16 (p < 0.05), as well as between the groups non-pregnant day 16 and pregnant day 16 (p < 0.01). The HSD17B2 is differentially expressed in pregnant and not pregnant cows but IFNτ-independently. These results offer promising approaches for the development of early indirect pregnancy detection in cattle.

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Bentrup, A.-K., 2020. Entwicklung eines epithelzellbasierten Bioassays zum frühen indirekten Trächtigkeitsnachweis beim Rind. Hannover.
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