Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Dynamics and regulation of the actin cytoskeleton in the motoneuron disease Spinal Muscular Atrophy (SMA)

Walter, Lisa Marie

Spinal Muscular Atrophy (SMA) is a neurodegenerative disease characterized by the progressive loss of lower motoneurons in the spinal cord and brainstem. Patients suffer from proximal muscle weakness and later atrophy leading to death in childhood in the most severe cases. Besides motoneurons as the primary pathological targets, other peripheral tissues such as skeletal muscle are affected as well. SMA is a monogenic disease caused by the homozygous deletion or mutation of the SMN1 gene. However, it still remains elusive why motoneurons are particularly susceptible to the loss of the ubiquitously expressed Survival of motoneuron (SMN) protein. Several findings support the hypothesis that the actin cytoskeleton plays a crucial role in the disease. SMN directly interacts with the actin-binding protein profilin2 and its loss results in profilin2 hyperphosphorylation. However, it has not been investigated yet which kinases may be involved and how phosphorylation of profilin2 affects its functions. Another link to the involvement of the actin cytoskeleton in SMA has been found by the discovery of actin rods in several cellular and mouse SMA models. Transient formation of these structures is beneficial for the cell under stress conditions. However, their persistence was reported to contribute to disease pathogenesis in Alzheimer and Huntington disease patients. Little is known about signaling pathways leading to actin rod formation in SMA and their role in motoneuron degeneration. The aim of this study was to characterize profilin2 hyperphosphorylation and actin rod formation in SMA to advance our understanding about the contribution of actin cytoskeleton dysregulation in motoneuron pathogenesis. Moreover, we wanted to analyze muscle-intrinsic pathways and their potential as therapeutic targets to alleviate muscle pathogenesis. In our first study, we analyzed the composition of actin rods in SMN-depleted cells by LC-MS-based proteomics. We found an enrichment of proteins involved in several pathways essential for cellular function. Additionally, profilin2 binds to actin rods. Further analysis revealed a contribution of profilin2 and its upstream kinase RhoA-associated coiled-coil kinase (ROCK) in actin rod formation in SMA. In the second part of this dissertation, we assessed the impact of single-site phosphorylation of profilin2 on its binding properties to its interaction partners actin, proteins with poly-L-proline (PLP)-stretches and phospholipids such as phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate (PIP2). Profilin2 phosphorylation on specific amino acid residues acts in a switch-like mechanism differentially regulating its affinity to each interaction partner. In the third study, we investigated the binding properties of profilin2 under control and SMN knock-down conditions. It has been found that profilin2 has an enhanced affinity for PLP when SMN is depleted. As profilin2 interacts specifically with synaptic PLP-proteins, this finding indicates an involvement in impaired neurotransmitter homeostasis in SMA. Moreover, we identified several kinases and a phosphatase which target profilin2 directly or indirectly. In the fourth part, we found a muscle-intrinsic defect in the glucocorticoid (GC)-Krüppel-like factor 15 (KLF15)-branched chain amino acid (BCAA) axis in SMA mice. Addressing this pathway by perinatal administration of the GC prednisolone or genetic intervention by overexpressing KLF15 attenuates the disease phenotype. Moreover, dietary intervention by supplementing BCAAs in symptomatic SMA mice prolongs survival and enhances weight gain. In conclusion, the results of this dissertation show novel potential avenues for treatment strategies in combination with a SMN-enhancing drug which may help to attenuate the disease phenotype. Targeting profilin2 hyperphosphorylation may be a promising candidate to improve motoneuron pathogenesis. Muscle-intrinsic perturbations may be addressed pharmacologically with GCs or by dietary intervention with BCAAs.

Die Spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die vorwiegend im Kindesalter auftritt und im schwersten Verlauf zum frühzeitigen Tod führt. Die Krankheit ist durch die progressive Degeneration der unteren Motoneurone im Rückenmark und Hirnstamm gekennzeichnet, welches eine proximale Muskelschwäche und Muskelatrophie verursacht. Obwohl Motoneurone primär betroffen sind, weisen auch periphere Organe, wie der Skelettmuskel, intrinsische Defekte auf. SMA ist eine monogenetische Erkrankung, die durch die homozygote Deletion oder Mutation des SMN1 Gens hervorgerufen wird. Dennoch ist bisher nicht bekannt, weshalb der Mangel des ubiquitär exprimierten Survival of motoneuron (SMN) Proteins speziell zur Degeneration der Motoneurone führt. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass das Aktin Zytoskelett eine wichtige Rolle bei der Erkrankung spielt. Das SMN Protein interagiert mit dem Aktin-bindenden Protein Profilin2, welches unter SMA-Bedingungen hyperphosphoryliert vorliegt. Allerdings ist bisher unklar, welche Kinasen an diesem Prozess beteiligt sind und welchen Einfluss die Phosphorylierung von Profilin2 auf dessen Funktionen ausübt. Ein weiterer Hinweis, der für die Beteiligung des Aktin Zytoskeletts bei der SMA spricht, ist die Entdeckung von actin rods in mehreren Zell- und Mausmodellen der SMA. Die Bildung dieser Strukturen dient der Zelle, um unter Stressbedingungen zu überleben. Allerdings zeigte sich, dass als Aggregate persistierende actin rods, die nicht abgebaut werden, zur Pathologenese von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer oder Huntington beitragen. Bislang ist wenig bekannt, über Signalwege, die beim Aufbau der actin rods in SMA involviert sind, oder welche Rolle diese Strukturen bei der Motoneurondegeneration spielen. Das Ziel dieser Studie war die Charakterisierung der Hyperphosphorylierung von Profilin2 und der actin rods. Dies sollte dazu beitragen, unser Verständnis, ihrer Funktionen bei der SMA Pathogenese, zu verbessern. Zusätzlich war das Ziel, muskel-intrinsische Defekte zu identifizieren und therapeutisch zu adressieren. In dem ersten Teil der Studie wurde die Zusammensetzung der actin rods mittels LC-MS-basierter Proteomik analysiert. Hier wurden zahlreiche Proteine identifiziert, die an Prozessen beteiligt sind, die essentiell für die Funktion der Zelle sind. Zusätzlich fanden wir Profilin2 an actin rods gebunden. Weitere Untersuchungen ergaben, dass sowohl Profilin2 als auch dessen Kinase RhoA-associated coiled-coil kinase (ROCK) an der Bildung der actin rods beteiligt sind. Im zweiten Part untersuchten wir den Effekt der Phosphorylierung einzelner Aminosäurereste von Profilin2 auf dessen Bindung an die Interaktionspartner Aktin, Proteinen mit Poly-L-Prolinen (PLP)-Bereichen und Phospholipiden wie Phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphat (PIP2). Phosphorylierung von Profilin2 an spezifischen Resten wirkt als regulatorischer Schalter, um bestimmte Interaktionen differenziell zu modulieren. In der dritten Teilstudie analysierten wir weitergehend die Bindungseigenschaften von Profilin2 unter Kontroll- und SMA-Bedingungen. Unter Verlust des SMN Proteins bindet Profilin2 stärker an PLP. Da Profilin2 spezifisch mit synaptischen PLP-Proteinen interagiert, deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass die veränderten Bindungseigenschaften zur gestörten Neurotransmitterhomöostase in der SMA beitragen. Des Weiteren identifizierten wir mehrere Kinasen und eine Phosphatase, die direkt oder indirekt an der Phosphorylierung von Profilin2 beteiligt sind. Im vierten Teil zeigten wir eine muskel-intrinsische Dysregulation der Glukokortikoid-Krüppel-like factor 15 (KLF15)-verzweigtkettige Aminosäure Signalachse in SMA Mäusen. Die Behandlung von perinatalen SMA Mäusen mit dem Glukokortikoid Prednisolon oder die genetische Intervention durch Überexpression von KLF15 verbessert den Krankheitsphänotyp. Zudem stellten wir über die Zugabe von verzweigtkettigen Aminosäuren ins Futter der SMA Tiere einen positiven Effekt auf ihr Überleben und ihre Gewichtszunahme fest. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Dissertation potentielle therapeutische Wege auf, um spezifische Defekte in der SMA zu adressieren. Zum einen könnten Medikamente, die auf die Normalisierung der Profilin2 Phosphorylierung abzielen, zur Linderung des Motoneuron Phänotyps beitragen. Muskel-intrinsische Defekte wiederum könnten über pharmakologische oder diätische Behandlungen mit Glukokortikoiden bzw. verzweigtkettigen Aminosäuren behandelt werden.

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Walter, L.M., 2020. Dynamics and regulation of the actin cytoskeleton in the motoneuron disease Spinal Muscular Atrophy (SMA). Hannover.
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