Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Impact of traditional medicinal plants on host pathogen interaction during Staphylococcus aureus infection

Baien, Shima Hassan Mohamed

Herbal medicine is one of the most important and effective therapies all over the world, especially in developing countries. They are used to treat different diseases such as inflammation, infectious diseases, metabolic disorders, etc. Based on traditional usage a number of several bioactive compounds have been explored from medicinal plants. Indeed, plant derivatives as polysaccharides, proteoglycans or glycoproteins are promising bioactive compounds. They have broad-spectrum biological activities such as immunomodulatory effects, antibacterial and antiviral effect among others. Gum arabic (GA) is a well-known dried gummy exudate from stems and branches of Acacia (A.) Senegal (L) Willdenow trees. Chemically GA is a water-soluble polysaccharide and has highly branched complex arabinogalactan protein fractions. In the traditional medicine, it is known that GA has anti-inflammatory, anti-diarrhoea and anti-bacterial effects. Staphylococcus (S.) aureus and Escherichia (E.) coli are worldwide pathogenic bacteria that cause life-threating infections in human and animals. Unfortunately, misuse and overuse of antibiotics lead to emerging drug resistant strains that are difficult to treat. For this reason, developing new treatment strategies to overcome these problems are urgently needed. One of these strategies is boosting host immune cells against invading pathogens. Therefore, the immunomodulatory effects of GA on the antimicrobial activity of human and bovine granulocytes will be elucidated in this thesis. Furthermore, the direct antibacterial effect of GA against three different S. aureus strains and two E. coli strains will be elucidated. Firstly, a new protocol to isolate pure and active bovine granulocytes from fresh blood was developed (Chapter 2). This model shall then be used as a model to study the effect of GA on the antimicrobial activity of bovine granulocytes in vitro. Thus, we compared K3EDTA and Lithium heparin as an anticoagulant to isolate granulocytes from bovine blood. Moreover, the effect of different RBCs lysis methods was investigated. We found that density gradient centrifugation of K3EDTA-blood results in higher purity of bovine granulocytes compared to Lithium heparin-blood. In contrast to water lysis, NaCl lysis method is recommended to avoid pre-stimulation of cells that may occur during hypotonic water lysis. Therefore, we used a combination of K3EDTA-blood and NaCl lysis method during our study to isolate bovine granulocytes. Secondly, the effect of GA on the antimicrobial activity of freshly isolated bovine or human granulocytes was investigated (Chapter 3). Interestingly, natural crude extract (NCE) and ethanol precipitate (EP) enhanced the antimicrobial activity of granulocytes by the induction of intracellular ROS production. In line with these data, NCE increased the phagocytosis rate of E. coli. No effect was seen on NET-formation that mediates extracellular killing of extracellular bacteria like S. aureus. As a next step, the direct antibacterial effect of NCE, EP and commercial GA (CGA) on S. aureus strains and E. coli strains was tested (Chapter 3). Also GA showed significant growth inhibition in a concentration-dependent manner in the case of S. aureus Newman, S. aureus Rd5 and E. coli 25922, but not in the case of S. aureus USA300 and E. coli K1.Transmission electron microscopic analysis confirmed an antibacterial effect of GA on the bacteria. Interestingly, the effect of EP, which contains fewer sugars, was tested and caused a similar antibacterial effect on bacteria as well as an increased oxidative burst of the granulocytes. Finally, we assume that the complex composition of GA extracts, not only the sugars alone, exhibit this biological activity on bacteria directly and enhance the antimicrobial activity of granulocytes. In summary, we show that GA has a slight bacteriostatic effect. GA boosts the antimicrobial activities of granulocytes through increasing production of intracellular ROS which may lead to more phagocytosis and intracellular killing of intracellularly invading pathogens.

Pflanzlich basierte Medizin ist eine der wichtigsten und effektivsten Therapieformen weltweit, mit besonderer Bedeutung, speziell in Entwicklungsländern. Sie wird genutzt um verschiedene Krankheitsformen wie Entzündungen, Infektions und Stoffwechselerkrankungen zu behandeln. Nicht zuletzt durch die lange traditionelle Anwendung von Pflanzen in der Heilkunde wurde eine Vielzahl bioaktiver Wirkstoffe entdeckt. Derivate wie Polysaccharide, Proteoglykane und Glyko-proteine zählen dabei zu den vielversprechendsten Komponenten. Sie zeigen ein breites Spektrum biologischer Aktivität wie, immunmodulatorischer Effekte, antivirale oder antibakterielle Wirkung. Gum arabic (GA) ist ein bekanntes, gummiartiges Exsudat aus dem Stamm und der Rinde des Acacia Senegal (L). Willdenow Baumes. Chemisch ist das Exsudat ein wasserlösliches Polysaccharid mit hohem Verzweigungsgrad und komplexen Arabinogalactan-Protein Fraktionen. In der traditionellen Pflanzenheilkunde ist GA bekannt als Wirkstoff mit entzündungshemmenden, Diarrhö lindernden und antibakteriellen Effekten. Staphylococcus (S.) aureus und Escherichia (E.) coli sind ubiquitäre pathogene Bakterien, die lebensbedrohliche Infektionserkrankungen in Mensch und Tier verursachen. Übermäßiger und missbräuchlicher Umgang mit Antibiotika führte zum Auftreten von antibiotikaresistenten Erregerstämmen, die schwierig zu therapieren sind. Um diese Problem zu lösen ist die Entwicklung neuer Therapieansätze dringend erforderlich. Ein Ansatz ist dabei die Verstärkung der körpereigenen Immunzellen und ihrer Antwort auf eindringende Pathogene. Aus diesem Grunde werden in dieser These die immunmodulatorischen Effekte von GA auf die antimikrobielle Aktivität humaner und boviner Granulozyten aufgeklärt. Außerdem wird die direkte antibakterielle Wirkung von GA gegen drei S. aureus und zwei E. coli Stämme erläutert. Zuerst wurde ein neues Protokoll zur Isolation reiner und aktiver boviner Granulozyten aus frischen Blut (Kapitel 2) entwickelt. Dieses wurde als Modell genutzt für Studien zum Effekt von GA auf die antimikrobielle Aktivität boviner Granulozyten in vitro. In dieser Studie wurden die Antikoagulantia K3EDTA und Lithium – Heparin bei der Isolation boviner Granulozyten aus Blut verglichen und überdies der Effekt verschiedener Methoden zur Lysis der roten Blutkörperchen untersucht. Die Dichtegradienten Zentrifugation mit K3EDTA 2 behandeltem Blut resultierte in einer höheren Reinheit der bovinen Granulozyten, verglichen mit Lithium – Heparin behandeltem Blut. Im Gegensatz zur hypotonischen Lysis durch Wasser wurde bei der NaCl basierten Lysis eine mögliche prä-Stimulation der Granulozyten verhindert. Daraus ergab sich die genutzte Kombination von K3EDTA behandeltem Blut und einer NaCl Lysis für die Isolation boviner Granulozyten für die weiteren Experimente. Als zweites wurde der Effekt von GA auf die antimikrobielle Aktivität von frisch isolierten bovinen und humanen Granulozyten untersucht (Kapitel 3). Interessanterweise verstärkten das natürliche Extrakt (natural crude extract (NCE)) und das Ethanol Präzipitat (EP) den antimikrobiellen Effekt der Granulozyten durch die Induktion der intrazellulären ROS-Produktion.Damit einhergehend konnte gezeigt werden, dass NCE zu einer erhöhten Phagozytoserate von E. coli führte. Es konnte kein Effekt auf die Ausbildung von neutrophilen extrazellulären Fallen beobachtet werden, welche die Abtötung extrazellulärer Bakterien wie S. aureus vermitteln würde. Anschließend wurde der direkte antibakterielle Effekt von NCE, EP und kommerziell erworbenem GA (CGA) auf S. aureus und E. coli Stämme getestet (Kapitel 3). In einem dosisabhängigen Schema zeigte GA eine Wachstumsinhibition im Fall von S. aureus Newman, S. aureus Rd5 und E. coli 25922, jedoch nicht für die Stämme S. aureus USA300 und E. coli K1. Mittels Transmissionselektronenmikroskopie konnte der antibakterielle Effekt von GA bestätigt werden. Bemerkenswert war, dass das EP, welches weniger Saccharide enthält, in den Experimenten einen ähnlichen antibakteriellen Effekt zeigte und einen verstärkten oxidativen Schub in den Granulozyten verursachte. Abschließend kann angenommen werden, dass die komplexe Komposition des GA Extraktes, jedoch nicht die Saccharide allein, zur biologischen Aktivität führen, in Bezug auf die direkten Effekte auf Bakterien, als auch die Verstärkung der antimikrobiellen Aktivität der Granulozyten. Zusammengefasst wurde gezeigt, dass GA einen leichten bakteriostatischen Effekt aufweist. GA verstärkt die antimikrobielle Aktivität von Granulozyten durch gesteigerte intrazelluläre ROS-Produktion, die wiederum zu einer erhöhten Phagozytose und intrazellulärer Abtötung von intrazellulären Pathogenen führt.

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Baien, S.H.M., 2020. Impact of traditional medicinal plants on host pathogen interaction during Staphylococcus aureus infection. Hannover.
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