Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Characterization of temperature sensitive mutants of bovine viral diarrhea virus : Attenuation and mechanisms of viral cytopathogenicity

Suckstorff, Oliver

Das Pestivirus Bovine Virusdiarrhö Virus (BVDV) existiert in zwei Biotypen: nicht-zytopathogen (nzp) und zytopathogen (zp), welche anhand ihres Effektes auf Zellkulturen unterschieden werden können. In dieser Studie wurden drei temperatursensitive (ts) Mutanten des zp BVDV-Stammes CP7 charakterisiert, welche einen temperaturabhängigen Zytopathogenitätsverlust bei hohen Temperaturen (39.5 °C) zeigen. In jeder dieser drei Mutanten wurde eine Punktmutation in der für das Nichtstrukturprotein (NS) 4B oder NS5A kodierenden Region gefunden, welche verantwortlich ist für den temperaturabhängigen Verlust der Zytopathogenität. Rekonstruierte ts (rts) Mutanten wurden durch die Einführung der identifizierten Punktmutationen in den ursprünglichen Stamm CP7 erzeugt. Die Anwesenheit von freiem NS3 zu frühen und späten Zeitpunkten nach einer Infektion und eine gesteigerte virale RNA-Produktion sind Kennzeichen eines zp Biotyps. Zellen, welche mit den ts und rts Mutanten infiziert waren, exprimierten NS3 bei niedriger (33 °C) und hoher Temperatur (39.5 °C) und somit unabhängig von ihrem jeweiligen Biotyp. Die Effizienz der viralen RNA-Produktion der ts Mutanten war bei 33 °C vergleichbar zu CP7. Im Gegensatz zu CP7 führt der Verlust der Zytopathogenität nach Infektionen mit den ts Mutanten zu einer reduzierten viralen RNA-Synthese bei 39.5 °C. Es ist bekannt, dass verschiedene Zelltodmechanismen, einschließlich Apoptose und Autophagie, während einer Infektion mit BVDV aktiviert werden. Der Zelltod nach Infektion mit zp BVDV-Stämmen ist auf eine Aktivierung der Apoptose zurückzuführen. Übereinstimmend damit konnte, in Zellen welche mit CP7 den ts und rts Mutanten infiziert waren, eine Korrelation zwischen Zytopathogenität und der Aktivierung von Apoptose festgestellt werden. Weitere Untersuchungen zeigten, dass weder der extrinsische noch der intrinsische apoptotische Signalweg während einer Infektion mit den ts oder rts Mutanten aktiviert wurden. Bei 33 °C und 39.5 °C konnte eine geringe Aktivierung des intrinsischen apoptotischen Signalweges in CP7-infizierten Zellen festgestellt werden. Die Unfolded Protein Response (UPR) wurde als ein möglicher alternativer Signalweg für die Aktivierung von Apoptose untersucht. Es konnte keine Aktivierung der UPR nach Infektionen mit CP7, den ts sowie rts Mutanten festgestellt werden, unabhängig von der verwendeten Inkubationstemperatur und somit dem Biotyp. Der Signalweg, welcher zu einer Aktivierung von Apoptose führt, bleibt damit unbekannt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung eines anderen Mechanismus des Zelltodes, Autophagie, unabhängig von der Inkubationstemperatur mit dem Auftreten von Zytopathogenität korreliert. In dieser Doktorarbeit wurden ts und rts Mutanten des cp BVDV-Stammes CP7 biologisch charakterisiert. Diese ts Mutanten, mit der Fähigkeit, ihren Biotyp abhängig von der Inkubationstemperatur zu ändern, stellen ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung von BVDV induzierter Zytopathogenität dar und könnten dabei helfen, komplexe Virus_Wirt_Interaktionen zu untersuchen, welche zum Virus-induzierten Zelltod führen. Mit Hilfe dieser ts Mutanten, konnte gezeigt werden, dass das Auftreten eines zp Biotyps mit der Aktivierung von Apoptose und Autophagie korreliert. Weitere Untersuchungen zur Identifizierung von Signalwegen, welche zur Aktivierung von Apoptose und Autophagie durch diese Mutanten führen, könnten ein Ziel zukünftiger Untersuchungen darstellen.

The pestivirus Bovine viral diarrhea virus (BVDV) exists in two biotypes: noncytopathic (ncp) and cytopathic (cp), which can be distinguished by their effect on cultured cells. In this study, three temperature sensitive (ts) mutants of the cytopathic BVDV strain CP7 were characterized, which showed a temperature-dependent loss of cytopathogenicity at high temperature (39.5°C). A point mutation in the nonstructural protein (NS) 4B or NS5A encoding region of all three ts mutants is responsible for this temperature dependent change in biotype. Reconstructed ts (rts) mutants were created by reintroduction of the identified mutations into the parental strain CP7. Presence of free NS3 at early and late stages of infection and an increased viral RNA synthesis are regarded as hallmarks of a cp biotype. Cells infected with the ts mutants and rts mutants expressed NS3 at low (33 °C) and high (39.5 °C) temperature, independent from their biotype. The viral RNA production efficiencies of the ts mutants and parental CP7 were comparable at 33°C. However, in contrast to CP7, the loss of cytopathogenicity in cells infected with the ts mutants correlated with a decrease of viral RNA synthesis at 39.5 °C. Different cell death mechanisms, including apoptosis and autophagy, are known to be activated during infections with BVDV. The death of cells after infections with cp BVDV strains is attributed to the activation of apoptosis. In congruence, a correlation between cytopathogenicity and apoptosis activation was observed in cells infected with CP7, the ts and rts mutants. Further investigations of pathways leading to the activation of apoptosis provided no evidence for an involvement of the extrinsic or the intrinsic apoptotic pathways after infection with the ts or rts mutants. At low and high temperatures, a slight activation of the intrinsic apoptotic pathway was detected in CP7 infected cells. As a possible alternative signaling pathway responsible for the activation of apoptosis, the unfolded protein response (UPR) was investigated. However, no activation of the UPR was determined after infection with CP7, the ts mutants or rts mutants independent of the incubation temperature and thus the biotype. Therefore, the pathway leading to the activation of apoptosis remains elusive. Additionally, activation of another cell death mechanism, autophagy, was demonstrated to correlate with cytopathogenicity independent of the incubation temperature. Taken together, this thesis presents a biological characterization of ts and rts mutants of the cp BVDV strain CP7. These mutants, with the ability to change their biotype depending on the temperature, represent valuable tools to investigate BVDV induced cytopathogenicity and may help to study complex virus-host interaction leading to virus induced cell death. With the help of these tools, it was demonstrated that the occurrence of a cp biotype correlates with the activation of apoptosis and autophagy in cells infected with CP7 as well as ts and rts mutants. However, further investigations into the pathways leading to the activation of apoptosis and autophagy through infections with these mutants are required in future studies.

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