Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Comparison of immune responses between chicken lines after vaccination with different infectious bursal disease (IBD) vaccines

Dobner, Marina

Diese These war Teil eines Forschungsverbundprojektes, welches das Ziel hatte den Einsatz einer neuen Zweinutzungshuhngenetik (Dualhuhn, Lohmann Dual, DT) mit hochleistenden Lege- und Masttyplinien (Lohmann Brown plus, LT; Ross 308, BT) zu vergleichen. Die Förderung erfolgte aus Mitteln des Zweckvermögens der Landwirtschaftlichen Rentenbank, Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Big Dutchman International GmbH und Lohmann Tierzucht GmbH. Mehrere Arbeitsgruppen befassten sich mit unterschiedlichsten Aspekten zur Tiergesundheit, zu den Haltungsbedingungen, zur Tierernährung, zum Verhalten bis hin zum Schlachtprozess und der Fleischqualität. Unser Projektteil untersuchte die Entwicklung der Immunkompetenz und Krankheitsresistenz des Dualhuhns im Vergleich zu hochleistenden BT- und LT- Hühnerlinien. Das Infektiöse Bursitis Virus (IBDV) wurde als Modellerreger verwendet. IBDV verursacht eine der wichtigsten immunsuppressiven Erkrankungen des Geflügels. Wirtschaftliche Verluste können aufgrund von erhöhter Mortalität und Empfänglichkeit gegenüber Sekundärerregern entstehen und stellen eine Bedrohung für die kommerzielle Geflügelhaltung dar. In Feld- als auch in experimentellen Studien wurde gezeigt, dass der genetische Hintergrund der Hühner die Empfänglichkeit gegenüber IBDV beeinflusst. Daher ist es notwendig, Genotyp-bedingte Unterschiede in der Immunantwort nach IBDV-Impfung aufzudecken, um die Gesundheit und den Schutz der Hühner im Feld sicherstellen zu können. Die Ziele der ersten Studie waren es, sowohl Genotyp-assoziierte Unterschiede in der Entwicklung des Immunsystems als auch in der angeborenen und erworbenen Immunantwort zu bestimmen. Außerdem wurde der Effekt eines rekombinanten Putenherpesvirus (HVT) – Infektiöse Bursitis (IBD) (HVT-IBD) Vektorimpfstoffes auf die untersuchten Immunparameter in die Untersuchungen mit einbezogen (1. Manuskript). Die relativen Immunorgangewichte, der strukturelle Aufbau und die Anzahl unterschiedlicher Immunzellpopulationen in der Bursa Fabricii (BF) (CD4+, CD8+ T Zellen) und in der Milz (CD4+, CD8+ T-Zellen, B-Zellen, Makrophagen) sowie die Anzahl der Germinalzentren (GC) in Milz und Zäkaltonsille wurden bestimmt. Neben der anti-IBDV spezifischen humoralen Immunantwort, wurde die sekundäre Antikörperantwort nach Impfung mit einem Infektiöse Bronchitis Virus (IBV) - Newcastle Disease Virus (NDV) Impfstoff untersucht. Schließlich wurden aus der Milz isolierte Leukozyten in vitro mit Concanavalin A (ConA) oder Lipopolysacchariden (LPS) stimuliert, um die Immunreaktivität von T Zellen und Makrophagen zu untersuchen. Der Genotyp hatte einen signifikanten Einfluss auf die Immunorganentwicklung, die anti-IBDV spezifische Antikörperantwort und die Interferon (IFN) γ und Stickstoffmonoxid (NO) Freisetzung nach Stimulation mit ConA und LPS. BT-Hühner zeigten die stärkste Immunantwort für alle untersuchten Immunparameter im Vergleich zu den LT-Hühnern, während die DT Tiere eine Zwischenstellung einnahmen. Die in ovo HVT-IBD Impfung beeinflusste verschiedene Immunparameter, welche zwischen den Genotypen variierten. Es waren sowohl die Anzahl der GC und Makrophagen in den Milzen, die Anzahl der CD4+ T Zellen in der BF als auch die anti-IBV und –NDV Antikörperantwort betroffen. Das Ziel der zweiten Studie war es, mehr über die Rolle der T-Zell vermittelten Immunantwort in der Regenerationsphase nach Impfung mit einem intermediär plus IBDV Lebendimpfstoff zu erfahren. Die Hühner wurden bis 28 Tage nach IBDV Inokulation untersucht. In zwei Experimenten wurden die unterschiedlichen Hühnerlinien an 28 oder 35 Tagen inokuliert. Neben den kommerziellen BT, LT und DT Hühnern wurden zusätzlich die hochempfänglichen, spezifisch-pathogen freien (SPF) LT-Hühner in den Vergleich miteinbezogen (2. Manuskript). Um zu bestimmen, wann die maternalen anti-IBDV-Antikörpertiter (MDA) unterhalb des Durchbruchtiters des Impfstoffes lagen, wurde die Deventer Formel angewendet. Die anti-IBDV-spezifische Antikörperantwort wurde bis 28 Tage nach Infektion untersucht. Die BF wurde auf makroskopische und mikroskopische Läsionen, auf B-Zell-Depletion und Repopulation untersucht. Außerdem wurde sowohl der Verlauf der intrabursalen CD4+ und CD8+ T-Zell Akkumulation, die Anzahl IBDV-Antigen positiver Zellen als auch die regulatorischen T-Zell (Treg)–assoziierten Zytokinexpression (Interleukin (IL)-10, Transforming growth factor (TGF)β4) untersucht. Der Verlauf der IBDV Infektion in den SPF Hühnern war zwischen den Versuchen vergleichbar. Auch die Ergebnisse der BT- und LT-Hühner waren für beide Experimente vergleichbar. Der Abfall der MDA der DT-Hühner wich stark von den anderen Genotypen ab, was zu einer verzögerten Induktion der Immunantworten, insbesondere in Exp. 1 führte. Die Studie zeigte einen signifikanten Einfluss des Genotyps auf die Dauer der Regenerationsphase der BF. Inokulierte BT Gruppen zeigten eine schnellere Regeneration, welche durch einen kontinuierlichen Abfall der intrabursalen CD4+ und CD8+ T-Zellen, der Bursa Läsions-Scores und der IBDV-Antigen Menge gekennzeichnet war. Signifikant erhöhte IL-10-mRNA-Level in der BF waren mit einer verlängerten intrabursalen T-Zell Akkumulation und Bursaläsionen assoziiert. Wir vermuten, dass Tregs und IL-10 an der Regeneration nach einer IBDV-Infektion beteiligt sind. Dies könnte durch eine unterschiedliche T-Zell Regulation zwischen den Hühnerlinien bedingt sein. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse Genotyp-assoziierten Unterschiede in den Immunantworten nach Applikation unterschiedlicher IBDV Impfstoffe. Basierend auf unseren Untersuchungen, sollte ein Genotyp-abhängiges Impfregime im Feld umgesetzt werden. Außerdem zeigt unsere Studie die Bedeutung der T-Zell Immunität beim Huhn auf, die zukünftig insbesondere in Bezug auf unterschiedliche T-Zell Subpopulationen und deren Funktionen näher untersucht werden sollte.

This thesis was part of a collaborative research project, which had the aim to compare the use of a newly developed dual-purpose chicken breed (Lohmann Dual, dual- purpose type, DT) with high-performing layer- and broiler type chickens (Lohmann Brown Plus, LT; Ross 308, BT). The project was funded by the German Government’s Special Purpose Fund held at Landwirtschaftliche Rentenbank, Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Big Dutchman International GmbH, and Lohmann Tierzucht GmbH. Different working groups addressed various important aspects, such as the nutrition, housing conditions as well as the behavior right up to the slaughtering process and meat quality comparing DT, LT and BT chickens. Our part of the project investigated the development of the immunocompetence and disease resistance comparing DT with high-performing LT and BT chickens. The infectious bursal disease virus (IBDV) was used a model pathogen. Infectious bursal disease (IBD) is one of the most important immunosuppressive viral diseases in poultry. Economic losses due to increased mortality rates and susceptibility to secondary pathogens threaten the commercial poultry production. Field observations and experimental studies indicate that the genetic background of chickens influences the susceptibility to IBDV. Therefore, the understanding of genotype-dependent variations in immune responses upon IBDV vaccination are needed to ensure the health and protection of chickens in the field. The aims of the first study were to determine genotype-associated differences in the development of the immune system and in innate and adaptive immune responses during the first weeks post hatch. Furthermore, the effect of the in ovo vaccination with a recombinant vectored herpesvirus of turkeys (HVT) – IBD vaccine on the investigated immune parameters was included (1st manuscript). The relative lymphoid organ weights, the structural development and numbers of different immune cell populations in the bursa of Fabricius (BF) (CD4+, CD8+ T-cells) and in the spleen (CD4+, CD8+ T-cells, B-cells, macrophages) as well as the number of germinal centers (GC) in the spleen and caecal tonsil (CT) were determined. Besides the anti-IBDV specific humoral immune response, the secondary antibody response after vaccination with an infectious bronchitis virus (IBV) - Newcastle disease (NDV) vaccine was investigated. Additionally, isolated spleen leukocytes were stimulated in vitro with either Concanavalin A (ConA) or lipopolysaccharides (LPS) to evaluate the immune responsiveness of T-cells and macrophages. It was demonstrated that the genotype significantly influenced the immune organ development, the anti-IBDV specific antibody response as well as interferon (IFN) γ release after ConA stimulation and nitric oxide (NO) release after LPS stimulation. For all the investigated parameters, BT birds showed the most vigorous immune responses compared to LT birds, while DT birds took an intermediate position. Early HVT-IBD vaccination at embryonic incubation day (EID) 18 affected various investigated immune parameters including the numbers of GC in the spleens, CD4+ T-cell numbers in the BF and macrophage populations in the spleens. Furthermore, HVT-IBD affected the anti-IBV and -NDV antibody response, which varied between the genotypes. The aim of the second study was to understand more about the role of T-cell mediated immune responses in the bursal recovery after vaccination with an intermediate plus IBDV strain. Birds were investigated up to 28 days post IBDV inoculation. Two experiments were conducted where the different chicken lines were inoculated at 28 or 35 days post hatch (dph) (Exp. 1, Exp. 2). Besides the commercial BT, LT and DT chicken lines also the highly susceptible specific-pathogen-free (SPF) LT chickens were included in the comparison (2nd manuscript). In order to determine the time point when anti-IBDV specific maternally derived antibodies (MDA) were below the breakthrough titer of the vaccine, the Deventer formula was applied. The anti-IBDV specific antibody response was determined by ELISA. The BF was investigated for macroscopic and microscopic lesions, B-cell depletion and repopulation. Furthermore, the development of intrabursal CD4+ and CD8+ T-cell accumulation, the number of IBDV antigen positive cells as well as regulatory T-cell (Treg)-related cytokine mRNA expression (interleukin (IL)-10, transforming growth factor (TGF) β4) in the BF was investigated. SPF chickens confirmed the IBDV inoculation in both experiments. The immune parameters for BT, LT and SPF chickens were comparable between the two experiments. DT chickens showed a high deviation in the decrease of maternally derived antibody (MDA) levels from the other chicken lines, which led to a delayed induction of immune responses after vaccination specifically in Exp. 1. The study revealed a significant genotype-influence on the duration of the bursal recovery process. Inoculated BT groups showed a faster recovery indicated by a continuous decline in intrabursal CD4+ and CD8+ T-cells, bursal lesion scores and IBDV-antigen loads. Significantly elevated levels of IL-10 mRNA expression in the BF were associated with a prolonged intrabursal T-cell accumulation and bursal lesions. We may speculate that Tregs and IL-10 might be involved in the recovery process after IBDV infection. This might be a result of a different T-cell regulation between the chicken lines. Taken together, our results provide new insights into genotype-associated variations in the immune responses after vaccination with different IBDV vaccines. Based on our studies, we suggest that genotype-dependent vaccination schedules should be implemented in the field. Furthermore, this study stresses the importance of the T-cell immunity in chickens, which should be investigated in the future with respect to defining different T-cell subpopulations and their functions.

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Dobner, M., 2019. Comparison of immune responses between chicken lines after vaccination with different infectious bursal disease (IBD) vaccines. Hannover.
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