Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Funktion von SOCS3 im Hinblick auf eine Rolle bei entzündlichen Hauterkrankungen

Grünewald, Jessica

In dieser Arbeit wird die Funktion des Proteins SOCS3 im Kontext immunologischer Prozesse der Haut untersucht. Hauptaugenmerk lliegt auf der Charakterisierung des Mechanismus des bereits beschriebenen Priming-Effekts, bei dem die Administration von dem Zytokin IL-27 zwei Stunden vor der Gabe von LPS zu einem signifikanten Anstieg der LPS induzierten pro-inflammatorischen Zytokine CXCL10, IL-6 und IL-23 führt, sowie der möglichen Beteiligung von SOCS3 an ebendiesem. Die Zentrale Arbeitshypothese dieser Studie ist, dass eine Interaktion von SOCS3 mit Smad3 maßgeblich am beobachteten Priming Effekt beteiligt ist. Durch den Einsatz des Protein-Biosynthese-Inhibitors Puromycin wird gezeigt, dass für den IL-27 vermittelten Priming Effekt eine Protein-Neusynthese essenziell ist. Des Weiteren zeigen sich wesentliche Abweichungen in Bezug auf das Priming Verhalten zwischen den primären humanen Monozyten und den Zelllinien MonoMac6 und THP-1. Um den Signalweg zu identifizieren, der für das IL-27 vermittelte Priming notwendig ist, werden folgende Signalweg-Inhibitoren verwendet: Zoledronsäure, S31-201 (STAT3), Fludarabin (STAT1), PD98059 (MEK1+2), U0126 (ERK), Ly294002 (PI3K) und Ruxolitinib (JAK1+2). Diese führen jedoch nicht zu einer Aufhebung des Priming-Effektes. Somit wird davon ausgegangen, dass die untersuchten Signalwege nicht primär bzw. singulär für das Priming verantwortlich sind. Die Möglichkeit, dass die Prä-Stimulation mit IL-27 zu einer erhöhten Expression des Toll-Like-4-Rezeptors (TLR4) führt und damit ursächlich für den Priming Effekt ist, wird durch eine durchflusszytometrische Analyse der Oberflächenexpression des TLR4 ausgeschlossen. Eine Beteiligung von SOCS3 an dem durch IL-27 induzierten Priming-Effekts kann durch Überexpressionsversuche von SOCS3 aufgrund methodischer Schwierigkeiten bei der Transfektion von humanen Antigen präsentierenden Zellen (APCs) nicht abschließend beurteilt werden. Zur Überprüfung des Einflusses des Primings auf die Smad3-Aktivität wird ein Smad3-ELISA aus Zytoplasma- und Kernproteinextrakten durchgeführt. Es ergeben sich durch die Prä-Stimulation mit IL-27 zu dem gewählten Zeitpunkt jedoch keine Änderungen, die eine eindeutige Beurteilung der Hypothese zuließe. Weitere Untersuchungen zum Priming von IL-27 identifizieren das Kontaktallergen Nickel als weiteren potenten TLR4-Aktivator, für den IL-27 induzierten Priming-Effekt. Damit gewinnt das IL-27 vermittelte Priming auch für die allergische Kontaktallergie an Bedeutung. Die Relevanz dieser Beobachtung wird dadurch verstärkt, dass in dieser Arbeit außerdem gezeigt wird, dass in humanen Monozyten die Stimulation mit Nickel selbst zu einer Induktion der IL-27-Expression führt. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass das durch IL-27 vermittelte Priming für TLR4-Antworten nicht nur im Kontext von bakteriellen Infektionen, wie sie häufig als Begleiterscheinung der AD anzutreffen sind, sondern auch bei der Nickel-vermittelten Kontaktallergie von zentraler Relevanz sind. Dieses Priming ist einer komplexen Zell- und Differenzierungsspezifischen Regulation unterworfen. Weitere Arbeiten hierzu sind notwendig, um den zu grundliegenden Mechanismus zu verstehen.

In this work, the function of the protein SOCS3 in the context of immunological processes of the skin is investigated. The main focus is on the characterization of the mechanism of the already described priming effect, in which the administration of the cytokine IL-27 two hours before the administration of LPS leads to a significant increase in LPS induced pro-inflammatory cytokines CXCL10, IL-6 and IL-23, as well as the possible involvement of SOCS3 in this same. The central working hypothesis of this study is that an interaction of SOCS3 with Smad3 is significantly involved in the observed priming effect. By using the protein biosynthesis inhibitor puromycin, it is shown that protein resynthesis is essential for the IL-27 mediated priming effect. Furthermore, there are significant differences in priming behavior between the primary human monocytes and the cell lines MonoMac6 and THP-1. To identify the signaling pathway required for IL-27 mediated priming, the following signaling pathway inhibitors are used: Zoledronic Acid, S31-201 (STAT3), Fludarabine (STAT1), PD98059 (MEK1+2), U0126 (ERK), Ly294002 (PI3K) and Rulitxoinib (JAK1+2). However, these do not lead to the suspension of the priming effect. Thus, it is assumed that the investigated signalling paths are not primarily or singularly responsible for priming. The possibility that the pre-stimulation with IL-27 leads to an increased expression of the Toll-Like-4 receptor (TLR4) and is thus the cause of the priming effect is excluded by a flow cytometric analysis of the surface expression of the TLR4. The involvement of SOCS3 in the PRIMing effect induced by IL-27 cannot be conclusively assessed by overexpression attempts of SOCS3 due to methodological difficulties in transfection of human antigen-presenting cells (APCs). To check the influence of priming on Smad3 activity, a Smad3-ELISA of cytoplasm and nuclear protein extracts is performed. However, pre-stimulation with IL-27 at the chosen time does not result in any changes that would allow a clear assessment of the hypothesis. Further priming studies of IL-27 identify the contact allergen nickel as another potent TLR4 activator, for the IL-27 induced priming effect. As a result, the IL-27 mediated priming also becomes more important for allergic contact allergy. The relevance of this observation is reinforced by the fact that this work also shows that in human monocytes stimulation with nickel itself leads to an induction of IL-27 expression. In summary, the priming for TLR4 responses mediated by IL-27 is of central relevance not only in the context of bacterial infections, which are often found as a side effect of AD, but also in the nickel-mediated contact allergy. This priming is subject to complex cell and differentiation-specific regulation. Further work is needed to understand the underlying mechanism.

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Grünewald, J., 2020. Untersuchungen zur Funktion von SOCS3 im Hinblick auf eine Rolle bei entzündlichen Hauterkrankungen. Hannover.
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