Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Sero- und Virulenzgentypisierung von Glaesserella parasuis- und Actinobacillus pleuropneumoniae-Isolaten aus Deutschland

Schuwerk, Lukas

Glaesserella (G.) parasuis und Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae stellen beim Schwein bedeutende Infektionserreger dar und können im Rahmen der Glässerschen Erkrankung bzw. der porzinen Pleuropneumonie zu massenhaften Tierverlusten führen. Beide Erreger aus der Familie der Pasteurellaceae zeichnen sich durch die Ausprägung zahlreicher Serotypen aus, die das wichtigste Differenzierungsmerkmal für Isolate der jeweiligen Spezies darstellen. Dabei ist der Bezug des Serotyps zur Virulenz bei G. parasuis unklar, während für A. pleuropneumoniae Ende des vergangenen Jahrhunderts das Serotyp-spezifische Auftreten der für die Virulenz hauptverantwortlichen Apx-Toxine beschrieben wurde. Da derzeit für beide Erreger keine aktuellen Daten zum Vorkommen von Serotypen und virulenzassoziierten Genen bei Isolaten aus Deutschland verfügbar sind, wurden in der vorliegenden Arbeit große Stammkollektive von G. parasuis (n=308) und A. pleuropneumoniae (n=222) mit molekulargenetischen Verfahren der Serotypisierung untersucht und hinsichtlich des Auftretens von virulenzassoziierten Genen charakterisiert. Bei G. parasuis wurde Serotyp 4 mit knapp 25% aller Isolate besonders häufig nachgewiesen, während Serotyp 3 nicht detektiert werden konnte. Die Serotypen 8, 10, 11, 14 und 15 wiesen jeweils Häufigkeiten unter 2% auf. Alle anderen Serotypen sowie nicht-typisierbare Isolate schwankten in ihrem Auftreten zwischen 3,6% und 12,3% des Kollektivs. Die weitergehende Differenzierung der Serotypen 5 und 12 (n=46) ergab eine Verteilung von 61% Serotyp 12 und 35% Serotyp 5 (4% nicht differenzierbar). Da die Unterscheidung von G. parasuis als asymptomatischer Schleimhautbesiedler oder virulenter Krankheitserreger bislang problematisch ist, wurden die leader sequence (LS-) und der Pathotyping-PCR als Verfahren der Virulenztypisierung auf das Stammkollektiv angewandt und mithilfe des klinischen Hintergrunds der Isolate („Silberstandard“) evaluiert. Dazu wurde das Kollektiv in die Gruppen der avirulenten Trägerisolate (n=29), der Pneumonie-assoziierten (n=204) sowie der systemischen Isolate (n=53) unterteilt. Hierbei konnte eine signifikante Assoziation zwischen Serotyp 6 sowie Serotyp 9 mit Trägerisolaten (n=29) beschrieben werden (p<0,0001 bzw. p=0,0007). Ergebnisse beider angewandter Verfahren der Virulenztypisierung klassifizierten diese Isolate vorwiegend als nicht virulent, sodass die beiden Serotypen in unserem Kollektiv als avirulente Schleimhautbesiedler angesehen werden können. Demgegenüber traten bei den pulmonalen und invasiven Isolaten vor allem die Serotypen 2, 4, 5, 12 und 13 auf. Eine Assoziation wurde hierbei lediglich zwischen Serotyp 4 und pulmonalen Isolaten entdeckt (p=0,036). Die beiden Verfahren der Virulenztypisierung klassifizierten die meisten pulmonalen und invasiven Isolate als virulent. Im Hinblick der Bewertung beider Verfahren der Virulenztypisierung bei Träger- und invasiven Isolaten konnte eine Überlegenheit der LS-PCR mit einer Testsensitivität von 90,6% und einer Spezifität von 72,4% gegenüber der Pathotyping-PCR (81,3% bzw. 66,7%) beobachtet werden. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der Serotypisierung von G. parasuis wiesen jene von A. pleuropneumoniae eine stark asymmetrische Verteilung zugunsten des Serotyps 2 auf, dem knapp 2/3 (n=142) des Kollektivs angehörten. Darüber hinaus war im Vergleich zwischen den Isolatgruppen der Jahre 2010-2013 und 2018-2019 eine signifikante Zunahme von Serotyp 2 ersichtlich (p=0,0004). Neben der Dominanz von Serotyp 2 folgt mit etwa 15% Serotyp 9/11, während andere Serotypen von A. pleuropneumoniae sowie nicht-typisierbare Isolate nur marginal vertreten waren. In diesem Kontext ist besonders das Auftreten der neu beschriebenen Serotypen 16 (n=2) und 18 (n=8) interessant. Unsere Untersuchungen zeigten, dass diese „neuen“ Serotypen mit geringer Prävalenz, jedoch bereits seit geraumer Zeit in Deutschland vorkommen. Die Virulenzgentypisierung von A. pleuropneumoniae, die anhand des Nachweises von apx-Toxingenen durchgeführt wurde, wies größtenteils deren Serotyp-spezifisches Vorkommen auf und bestätigte damit die Erkenntnisse früherer Studien. Dies kann jedoch nicht ohne Weiteres für die von uns charakterisierten Isolate des Serotyps 18 übertragen werden, da 75% (n=6) aller Isolate dieses Serotyps einheitlich vom „typischen“ apx-Genprofil des Referenzstammes 7311555 abwichen. Da das apx-Profil dieses Referenzstammes lediglich anhand weniger Isolate festgelegt wurde, kann die Einteilung in typisch & atypisch bei Serotyp 18 aufgrund der vorliegenden Ergebnisse neu diskutiert werden. Des Weiteren war das äußerst geringe Vorkommen (n=2) von NAD-unabhängigen, sogn. Biovar II Isolaten bei A. pleuropneumoniae aus Deutschland ersichtlich. Zusammenfassend zeichnet sich G. parasuis, im Gegensatz zur nahen verwandten Spezies A. pleuropneumoniae, durch das gehäufte Auftreten vieler verschiedener Serotypen sowie deren inkonsistenten Ausstattung an virulenzassoziierten Genen aus. Bei Kombination der Serotypisierung mit der LS-PCR kann jedoch eine tragfähige Aussage über das Virulenzpotenzial gegeben werden. Demgegenüber lässt sich bei A. pleuropneumoniae eine konvergente Entwicklung zugunsten des Serotyp 2 mit einer konstitutiven Ausstattung an Genen der Apx-Toxine erkennen, wodurch bei A. pleuropneumoniae der Serotyp bis auf wenige Ausnahmen das Virulenzpotenzial eines Isolats gut widerspiegelt.

Glaesserella (G.) parasuis and Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae are important infectious agents in pigs and can lead to massive animal losses in the context of Glaesser´s disease and porcine pleuropneumonia, respectively. Both members of the Pasteurellaceae family are characterised by the expression of numerous serotypes, which is the most important feature to differentiate isolates of the respective species. The association between serotype and virulence is unclear in G. parasuis, whereas for A. pleuropneumoniae the serotype-specific occurrence of the Apx-toxins, which are the main virulence factors of this pathogen, was described at the end of the last century. Since for either pathogen no current data are available on the occurrence of serotypes and virulence-associated genes in isolates from Germany, the present study examined large strain collections of G. parasuis (n=308) and A. pleuropneumoniae (n=222) for the occurrence of different serotypes and virulence-associated genes using published molecular methods. In G. parasuis, serotype 4 was detected particularly frequently with almost 25% of all isolates, whereas serotype 3 was not detected at all. Serotypes 8, 10, 11, 14 and 15 each showed frequencies below 2%. All other serotypes as well as non-typable isolates varied in their occurrence between 3.6% and 12.3% of the collection. Further differentiation of serotypes 5 and 12 (n=46) resulted in a distribution of 61% serotype 12 and 35% serotype 5 (4% not distinguishable). Since the differentiation of G. parasuis as an asymptomatic mucosal colonizer or virulent pathogen has been problematic so far, the leader sequence-(LS-) and the Pathotyping-PCR as methods of virulence typing were applied to the strain collection and were evaluated using the clinical background of the isolates ("silver standard"). For this purpose, the collection was divided into 3 groups, avirulent carrier isolates (n=29), pneumonia-associated (n=204) and systemic isolates (n=53). A significant association between serotype 6 and serotype 9 with carrier isolates (n=29) was found (p<0.0001 and p=0.0007, respectively). Results of both methods of virulence typing classified these isolates predominantly as non-virulent, so that the two serotypes can be considered as avirulent mucosal colonizers in our collection. In contrast, the pulmonary and invasive isolates were mainly found to belong to serotypes 2, 4, 5, 12 and 13. An association was found only between serotype 4 and pulmonary isolates (p=0.036). The two virulence typing methods classified most pulmonary and invasive isolates as virulent. With regard to the evaluation of both methods of virulence typing for carrier and invasive isolates, the LS-PCR had a test sensitivity of 90.6% and a specificity of 72.4% and, thus, was better than the Pathotyping-PCR, which showed a sensitivity of 81.3% and specificity of 66.7%. In contrast to the results of serotyping of G. parasuis, those of A. pleuropneumoniae showed a strongly asymmetrical distribution in favour of serotype 2, encompassing almost 2/3 (n=142) of the collection. In addition, a significant increase of the occurrence of serotype 2 was observed between the isolate groups of 2010-2013 and 2018-2019 (p=0.0004). Serotype 9/11 followed as the second most prevalent serotype with about 15% of the isolates, while other serotypes of A. pleuropneumoniae as well as non-typeable isolates were only marginally represented. In this context, the occurrence of the newly described serotypes 16 (n=2) and 18 (n=8) is particularly interesting. Our investigations showed that these "new" serotypes have been present for quite some time with low prevalence in Germany. The virulence typing of A. pleuropneumoniae, based on the detection of the apx-toxin genes, showed in general their serotype-specific occurrence and, thus, confirmed the findings of previous findings. However, this does not hold true for isolates of serotype 18, as 75% (n=6) of all isolates of this serotype deviated uniformly from the "typical" apx-gene profile of the reference strain 7311555. Since the apx-profile of this serotype was determined on the basis of only a few isolates including the reference strain, the classification as typical & atypical for serotype 18 is questionable. Furthermore, the extremely low incidence (n=2) of NAD independent (biovar II) isolates in German A. pleuropneumoniae was evident. In summary, G. parasuis, in contrast to its close relative A. pleuropneumoniae, is characterised by the abundant occurrence of many different serotypes and their inconsistent virulence-associated genes. However, when results of serotyping are combined with those of the LS-PCR, a reliable statement about the virulence potential can be made. On the other hand, A. pleuropneumoniae shows a convergent development in favour of serotype 2 with a constitutive equipment of Apx-toxin genes. Thus, with only few exceptions, the serotype of A. pleuropneumoniae reflects well the virulence potential of an isolate.

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Schuwerk, L., 2020. Sero- und Virulenzgentypisierung von Glaesserella parasuis- und Actinobacillus pleuropneumoniae-Isolaten aus Deutschland. Hannover.
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