Anwendung und vergleichende Validierung eines IgG-Protein-Microarrays für Serum und Fleischsaft zur multi-serologischen Untersuchung von Mastschweinen auf Herdenebene
Zur Überwachung des Auftretens von Zoonoseerregern in Schweinebeständen sowie zur Verbesserung des Gesundheitsmanagements im Stall ist die Entwicklung neuer kostengünstiger Diagnosemethoden für Schweinebestände erforderlich. Auf Grundlage der Schweine-Salmonellen-Verordnung werden in Deutschland bereits wertvolle Informationen zur Lebensmittelsicherheit, in Bezug auf das Vorkommen von Salmonella spp., bei Mastschweinen auf Herdenebene generiert. Es wäre jedoch von großem Vorteil, wenn es einen gemeinsamen Screening-Test für weitere Zoonoseerreger wie Y. enterocolitica, T. gondii und Trichinella spp. gäbe, da diese Erreger ebenfalls zu den wichtigsten biologischen Gefahren im Zusammenhang mit der Fleischuntersuchung von Schweinen zählen (EFSA 2011). Um eine umfassende serologische Überwachung dieser Zoonoseerreger in Schweinebeständen zu realisieren, fehlt es jedoch an einer kostengünstigen und routinetauglichen Methode. Aus diesem Grund wurde ein Protein-Microarray zum gleichzeitigen Nachweis von Immunglobulin G (IgG) Antikörpern gegen verschiedene Zoonoseerreger und Erreger von Atemwegserkrankungen bei Schweinen entwickelt. Dafür wurden Antigene von zehn verschiedenen schweinespezifischen Erregern (T. gondii, Y. enterocolitica, Salmonella spp., Trichinella spp., M. avium, Hepatitis E-Virus, M. hyopneumoniae, APP, PRRSV, Influenza-A-Virus) auf die Chip-Oberfläche eines Microarrays aufgetragen, um Serum und Fleischsaft von Schweinen auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen diese Antigene zu untersuchen. Für die Entwicklung des Microarrays wurde aus gepaarten Serum- und Fleischsaftproben von drei deutschen Schlachthöfen ein Referenzproben-Panel für die Microarray-Testungen erstellt. ELISA-Tests für die zehn verschiedenen Erreger wurden als Referenztests für alle Proben durchgeführt. Um die Testgenauigkeit der Antigene auf dem Microarray zu bewerten, wurden die ELISA-Testergebnisse als Referenz für die Erstellung von ROC-Analysen verwendet. Der Chip wurde zuerst in einem kleinen Reaktionsgefäß (ArrayTube) und danach in einem 96-Well-kompatiblen Format (ArrayStrip) getestet. Auf beiden Plattformen wurden Blutserum- und Fleischsaftproben eingesetzt. Das Serum wurde 1:50 und der Fleischsaft 1:2 verdünnt. Auf der ArrayTube Plattform wurden für die Analyse von zwei Zoonoseerregern (T. gondii, Y. enterocolitica) und drei Atemwegserregern (APP, M. hyopneumoniae, PRRSV) moderate bis hohe AUC-Werte erreicht. Auf der ArrayStrip-Plattform wurden für T. gondii, Y. enterocolitica, APP und M. hyopneumoniae moderate bis hohe AUC-Werte erreicht. Für den Vergleich zwischen Serum und Fleischsaft wurden Cohens-Kappa-Werte von 0,92 für T. gondii und 0,82 für Y. enterocolitica ermittelt. Bei Anwendung des Microarrays in zwei weiteren Laboren, wurden zwischen den Laboren Kappa-Werte zwischen 0,63 und 0,94 für diese beiden Zoonoseerreger erreicht. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die Microarray-Technologie einfach in Routinelabore integrierbar ist und optimale Voraussetzung für die Erstellung multi-serologischer Bestandsprofile bietet. Die serologischen Daten auf Herdenebene könnten zur Optimierung der Lebensmittelketteninformation verwendet werden und würden ein wertvolles Instrument zur kontinuierlichen Optimierung der Herdengesundheit darstellen.
In order to monitor the occurrence of zoonotic agents in pig herds as well as to improve herd health management, the development of new cost-effective diagnostic methods for pigs is necessary. The national salmonella monitoring in Germany already provides valuable food safety information on Salmonella spp. in fattening pigs at herd level. However, there is a high demand for a screening test for multiple zoonotic agents like Y. enterocolitica, T. gondii or Trichinella spp. as they belong to the most relevant biological hazards in the context of meat inspection of swine (EFSA 2011). In order to realize a broad serological monitoring of these pathogens, a cost-efficient diagnostic method suitable for routine testing has been missing so far. For this reason, a protein microarray based assay for the simultaneous detection of immunoglobulin G (IgG) antibodies against different zoonotic agents and pathogens causing respiratory diseases in pigs was developed. Antigens of ten different important swine pathogens (T. gondii, Y. enterocolitica, Salmonella spp., Trichinella spp., M. avium, Hepatitis E virus, M. hyopneumoniae, APP, PRRSV, influenza A virus) were spotted on microarray chips in order to test pig serum and pig meat juice for the occurrence of antibodies. A panel of reference samples for microarray analysis was created from paired pig serum and meat juice samples from three German abattoirs. ELISA tests for the ten different pathogens were performed as reference tests. To evaluate test accuracy of the antigens on the microarray, receiver operating characteristic (ROC) curve analysis using the ELISA test results as reference was performed for the different antigens. The chip was first tested in a small reaction vessel (ArrayTube) and thereafter in a 96-well compatible format (ArrayStrip). On both platforms, blood serum and meat juice samples were tested. Blood serum was diluted 1:50 and meat juice 1:2. On the ArrayTube platform, moderate to high area under curve values were achieved for the analysis of two zoonotic agents (T. gondii, Y. enterocolitica) and three respiratory pathogens (APP, M. hyopneumoniae, PRRSV). On the ArrayStrip platform, moderate to high area under curve values were achieved for T. gondii, Y. enterocolitica, APP and M. hyopneumoniae. Cohens kappa values of 0.92 for T. gondii and 0.82 for Y. enterocolitica were obtained for the comparison between serum and meat juice. When applying the microarray in two further laboratories, kappa values between 0.63 and 0.94 were achieved between the laboratories for these two pathogens. It was shown that microarray technology could be integrated easily into diagnostic laboratories and offers optimal prerequisites for the establishment of serological herd profiles. The serological data at herd level can be used to improve ‘food chain information’ and provides a valuable tool to continuously optimize herd health.
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