Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Development of an assay for the evaluation of Botulinum neurotoxin activity based on transgenic human stem cells differentiated to motor neurons

Schenke, Maren

Botulinum neurotoxins (BoNTs) are potent bacterial neurotoxins, which can cause respiratory failure due to paralysis of signal transmission from motor neurons (MNs) to the muscles. The high toxicity of the multitude of serotypes is based on the inhibition of exocytosis and therefore of neurotransmitter release through cleavage of SNARE proteins. The serotypes BoNT/A1 and B1 are produced industrially for traditional and aesthetic medicine. The toxins are produced by bacteria and purified from the culture medium with varying activity, which necessitates the potency assessment of every produced batch, requiring a high number of test animals. The currently validated in vitro assays are largely proprietary and only applicable to single BoNT serotypes, as the cleavage of the specific substrate protein is quantified. One alternative method has been developed based on the neuroblastoma cell line SIMA by the research group of Prof. G. Püschel at the University of Potsdam (Pathe-Neuschäfer-Rube et al. 2015). This method uses cells that have been transfected with a sequence coding for a luciferase reporter, to which a sorting tag was added, redirecting the luciferase to secretory vesicles. Upon depolarization, the luciferase is released from the secretory vesicles and produces bioluminescence when the corresponding substrate is added. The release of luciferase is inhibited by different BoNTs in a dose-dependent manner, making the assay suitable for the detection of various serotypes. So far, SIMA cells showed to be sensitive enough for BoNT/A1, but not B1 (Pathe-Neuschäfer-Rube et al. 2018). The cell type with the presumed highest sensitivity and physiological relevance, human MNs, were generated in this work from human induced pluripotent stem cells (iPSCs), with the aim to be used instead of SIMA cells for estimation of BoNT potency. For this purpose, three MN differentiation protocols were established and analyzed for the yield of MNs. In this work, the protocol based on Du et al. (2015) showed the highest yield with an average of 51% (34-84%) MNs, in a population of neurons, while an average yield of 16% (9-21%) and 14% (9-17%) was achieved for the protocols based on Maury et al. (2015) and Kroehne et al. (2017) respectively. In the differentiated cell populations, the production of molecules relevant for BoNT toxicity was analyzed on the gene and protein level. The different BoNT serotypes bind to characteristic gangliosides and synaptic proteins on the neuronal cell surface, which are utilized by the toxin for endocytosis into neurons. Inside the neuron, the toxin recognizes different proteins that are fundamental for exocytosis and cleaves them. While the differentiation protocols used in this work differed with regard to the yield of MNs, it could be shown that all protocols generate the molecular targets required for BoNT toxicity and should therefore be suitable for the estimation of BoNT potency. The gene expression levels of BoNT targets were found to be higher in MNs compared to SIMA cells, which might indicate higher sensitivity. In parallel to the establishment of the differentiation protocols, the luciferase reporter was integrated into human iPSCs by B. Schjeide in the research group of Prof. G. Püschel. The MN differentiation protocols were then applied to the transgenic iPSCs. In this work, it could be shown that the transgenic cells could be differentiated into MNs just as well as wild type cells and, in addition, that the luciferase was still expressed after the differentiation. The transgenic MNs were then tested with the assay protocol that was developed in the research group of Prof. G. Püschel, but no reliable reporter release could be detected upon addition of depolarizing buffer. None of the protocols used produced the same stimulation-dependent release as SIMA cells. However, a large amount of the reporter was found in the cell culture supernatant, which indicates that it is released prior to stimulation of the MNs. It appears that the assay principle cannot be transferred to MNs directly, which might have different reasons. On the one hand, the types of secretory vesicles primarily responsible for exocytosis differ between SIMA and MNs. This raises the question to which extent the luciferase can be correctly sorted in MNs. Another cause for the unspecific release of the luciferase found in this work might be the spontaneous exocytosis in neurons, which has been described in the absence of stimulation. This might result in continuous release, leading to depletion of the reporter to a level where no stimulation-dependent release is possible. The use of a different sorting tag, which targets the reporter to the neurotransmitter containing vesicles in MNs could improve stimulation-dependent luciferase release. Nevertheless, a substantially higher sensitivity of MNs compared to SIMA cells could be shown in this work by quantifying the cleavage of the corresponding substrate for BoNT/A1 in SIMA cells and MNs. The use of human MNs in a neurotransmitter release assay still needs to be achieved, but should therefore result in a viable alternative to the mouse lethality assay for the potency estimation of BoNTs.

Botulinum Neurotoxine (BoNTs) sind potente Nervengifte und können die Reizweiterleitung von Motoneuronen (MNs) zum Muskel stören, was zu einer letalen Atemlähmung führen kann. Die hohe Toxizität der Vielzahl von Serotypen basiert auf der Spaltung von für die Neurotransmitter-Freisetzung essentiellen Proteinen. Die Serotypen BoNT/A1 und B1 werden industriell hergestellt und in der klassischen und in der ästhetischen Medizin verwendet. Durch die Produktion durch Bakterien und Aufreinigung aus dem Kultivierungsmedium bedingt variiert die Aktivität des Toxins, was die Aktivitätstestung jeder produzierten Charge notwendig macht, wofür eine große Anzahl Versuchstiere gebraucht wird. Die bisher validierten Alternativmethoden sind zum größten Teil patentrechtlich geschützt und nur für einzelne Serotypen anwendbar, da sie auf der Bestimmung der Spaltung des spezifischen Substrates des jeweiligen Serotypen basieren. Eine Alternativmethode, die in der Arbeitsgruppe von Prof. G. Püschel an der Universität Potsdam entwickelt wurde, verwendet die Neuroblastom-Zelllinie SIMA (Pathe-Neuschäfer-Rube et al. 2015). Sie basiert auf der Verwendung von Zellen, die mit dem Gen einer Luciferase transfiziert wurden. Die Luciferase enthält eine zusätzliche Signalsequenz und wird in sekretorische Vesikel verpackt. Werden diese Zellen depolarisiert, wird die Luciferase freigesetzt, welche durch Zugabe des entsprechenden Luciferase-Substrates Biolumineszenz produziert. Dieser Schritt wird konzentrationsabhängig von allen BoNTs inhibiert, was den Assay für die Detektion aller Serotypen geeignet macht. In dem bisherigen Assay haben sich die SIMA-Zellen als sensitiv gegenüber BoNT/A1, aber nicht BoNT/B1 gezeigt (Pathe-Neuschäfer-Rube et al. 2018). Der Zelltyp mit der höchsten Sensitivität und physiologischen Relevanz sind humane MNs, welche in dieser Arbeit aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) differenziert wurden mit dem Ziel, sie an Stelle der SIMA-Zellen für die Aktivitätsbestimmung von BoNTs zu verwenden. Dazu wurden drei Protokolle für die Differenzierung von MNs etabliert und auf den jeweiligen Anteil an generierten MNs analysiert. Das auf der Publikation von Du et al. (2015) basierende Protokoll zeigte die höchste Ausbeute mit durchschnittlich 51% (34-84%) MNs in einer vorwiegend neuronalen Population, während für die Differenzierungen basierend auf Maury et al. (2015) und Kroehne et al. (2017) eine durchschnittliche Ausbeute von jeweils 16% (9-21%) und 14% (9-17%) erreicht wurden. Die differenzierten Zellen wurden dann auf Protein- und Gen-Ebene auf die Produktion von für die BoNT-Toxizität relevanten Molekülen untersucht. Die verschiedenen BoNT-Serotypen binden an charakteristische Ganglioside und synaptische Proteine auf der neuronalen Zelloberfläche und nutzen diese, um durch Endozytose aufgenommen zu werden. Im Lumen der Zelle werden dann für die Exozytose essentielle Proteine durch BoNTs erkannt und gespalten. Für die in dieser Arbeit verwendeten Differenzierungsprotokolle konnten alle untersuchten Zielstrukturen nachgewiesen werden, daher sollten die differenzierten Zellen für die Verwendung in Aktivitätstests mit BoNTs geeignet sein. Die Genexpressionslevel dieser Zielstrukturen waren höher in MNs im Vergleich zu SIMA-Zellen, was auf eine höhere Sensitivität von MNs hinweisen könnte. Parallel zur Etablierung der Differenzierungs-protokolle wurde durch B. Schjeide in der Arbeitsgruppe von Prof. G. Püschel der Luciferase-Reporter in die verwendeten iPSCs integriert. Die transgenen iPSCs wurden dann zu MNs differenziert und analysiert, wobei festgestellt wurde, dass die Differenzierbarkeit unverändert war, sowie dass das Reporter-Enzym auch nach der Differenzierung weiterhin exprimiert wird. Die so generierten MNs wurden nach dem von der Arbeitsgruppe um Prof. G. Püschel entwickelten Protokoll mit depolarisierendem Puffer behandelt, was jedoch keine verlässliche Luciferase-Freisetzung bewirkte. Bei keinem der etablierten Differenzierungsprotokolle konnte eine stimulationsabhängige Freisetzung vergleichbar mit der Freisetzung in SIMA-Zellen festgestellt werden. Allerding wurde eine große Menge Luciferase im Zellkulturüberstand detektiert, was eine Luciferase-Freisetzung vor der eigentlichen Durchführung des Versuches indiziert. Es lässt sich folgern, dass sich die Testmethode nicht direkt auf MNs übertragen lässt, wofür es verschiedene Gründe geben kann. Ein Unterschied zwischen MNs und SIMA-Zellen liegt in der Art der sekretorischen Vesikel, die vorrangig für Exozytose verwendet wird. Dadurch ist unklar, ob die Luciferase in MNs überhaupt so wie in den SIMA-Zellen verpackt werden kann. Eine andere Ursache für die unspezifische Freisetzung der Luciferase könnte die in Neuronen beschriebene spontane Exozytose in Abwesenheit von Stimulation sein. Dieses könnte zur Folge haben, dass die Luciferase-Mengen in den MNs zu gering sind, um eine stimulationsabhängige Freisetzung induzieren zu können. Die Verwendung einer anderen Signalsequenz, die dazu führt, dass die Luciferase in die neurotransmitterhaltigen Vesikel der MNs verpackt wird, könnte eine stimulationsabhängige Luciferase-Freisetzung ermöglichen. In dieser Arbeit konnte trotzdem gezeigt werden, dass MNs substanziell empfindlicher sind als SIMA-Zellen, indem die BoNT/A1-Aktivität in diesen Zellen durch Spaltung des entsprechenden Substrates quantifiziert wurde. Die Übertragung des Testprinzips auf humane MNs sollte demnach in einer guten Alternative zum Tierversuch für die Aktivitätsbestimmung von BoNTs resultieren.

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Schenke, M., 2020. Development of an assay for the evaluation of Botulinum neurotoxin activity based on transgenic human stem cells differentiated to motor neurons. Hannover.
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