Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Elucidation of molecular mechanisms by which deletion of connexin 43 in Sertoli cells prevents murine spermatogenesis, and investigation of the murine candidate gene Dmrtb1 in human testis showing normal and impaired spermatogenesis

Hilbold, Erika Anneliese

A significant decline in male reproductive function has been reported in recent years but many underlying causes are still unknown. By generating a conditional Sertoli cell-specific connexin 43 (Cx43) knockout mouse line (SCCx43KO), a translational mouse model was created. Cx43 is known as the predominant testicular gap junction protein and its expression is required for normal testicular development and successful spermatogenesis in different species and men. Adult SCCx43KO males are infertile and show, e.g., an arrested spermatogenesis at spermatogonial stage similar to human phenotypes. First obvious histomorphological differences are observable between eight- and ten-day-old SCCx43KO and wild type mice. Hence, molecular mechanisms and signaling pathways were studied in prepubertal SCCx43KO mice by performing next-generation sequencing (NGS). Additionally, candidate genes were investigated by qRT-PCR and immunohistochemistry. NGS revealed many significantly differentially expressed genes in the prepubertal SCCx43KO mice. Germ cell-specific genes were mostly downregulated and found to be involved in meiosis and spermatogonial differentiation (e.g., Dmrtb1, Sohlh1). In contrast, Sertoli cell-specific genes implicated in Sertoli cell maturation and proliferation were mostly upregulated (e.g., Amh, Fshr). Taken together, Cx43 in Sertoli cells appears to be required for the progression of the first wave of spermatogenesis, especially for the transition between mitosis and meiosis in germ cells, and for proper regulated Sertoli cell maturation. Besides, the murine candidate gene, Dmrtb1, was examined in corresponding human deficiencies using testicular biopsy specimens. According to its functions in murine spermatogenesis, a relevant role for DMRTB1 was found regarding the transition between mitosis and meiosis in human germ cells. Additionally, an altered DMRTB1 expression was observed in conjunction with testicular pathologies such as testicular germ cell tumors (TGCTs). Thus, for the first time, a murine candidate gene identified in the SCCx43KO mice was found to be critical for normal spermatogenesis and spermatogenic disorders in men, thereby confirming the SCCx43KO mouse line as a translational mouse model for studying male factor infertility and identifying genes which might be associated with TGCT development.

In den letzten Jahren wird vermehrt über eine signifikante Abnahme der männlichen Reproduktion berichtet, jedoch sind die zugrundeliegenden Ursachen größtenteils unbekannt. Mittels der Generierung einer Mauslinie (SCCx43KO), die durch einen konditionalen Knockout von Connexin 43 (Cx43) in Sertoli Zellen gekennzeichnet ist, entstand ein translationales Mausmodell. Im Hoden ist Cx43 das dominierende Gap Junction Protein und absolut erforderlich für eine normale Hodenentwicklung und eine erfolgreiche Spermatogenese in verschiedenen Spezies (inklusive Mensch). Adulte, männliche SCCx43KO Mäuse sind unfruchtbar und zeigen unter anderem einen Spermatogonienarrest, vergleichbar mit dem humanen Phänotyp. Zwischen jungen SCCx43KO Mäusen und Wildtyptieren sind erste offensichtliche, histomorphologische Unterschiede im Alter zwischen acht und zehn Tagen erkennbar. Folglich sind die molekularen Mechanismen und mögliche Signalwege in präpubertären Mäusen mittels Next Generation-Sequencing (NGS) untersucht worden. Ergänzend wurden murine Kandidatengene mit qRT-PCR und Immunhistochemie erforscht. Die NGS-Analyse ergab viele signifikant regulierte Gene in den präpubertären SCCx43KO Mäusen. Keimzell-spezifische Gene waren größtenteils herunterreguliert und an der Meiose oder der Differenzierung von Spermatogonien beteiligt (zum Beispiel Dmrtb1 und Sohlh1). Sertoli Zell-spezifische Gene hingegen, die in Verbindung mit der Sertoli Zell-Reifung und Proliferation stehen, waren vor allem hochreguliert (zum Beispiel Amh und Fshr). Zusammengefasst erscheint Cx43 an den untersuchten Tagen erforderlich für die Progression der ersten Spermatogenesewelle, insbesondere für den Übergang zwischen der Mitose und Meiose, sowie für eine korrekte Sertoli Zell-Reifung zu sein. Darüber hinaus ist Dmrtb1 mithilfe des Mausmodells als Kandidatengen zur vergleichenden Untersuchung an humanen Hodenbiopsien mit unterschiedlichen Spermatogenesestörungen identifiziert und untersucht worden. Übereinstimmend mit seinen Funktionen für die murine Spermatogenese, konnte eine relevante Rolle für DMRTB1 für den Übergang zwischen Mitose und Meiose humaner, männlicher Keimzellen ermittelt werden. Zusätzlich ist ein verändertes Expressionsmuster von DMRTB1 im Zusammenhang mit testikulären Erkrankungen festgestellt worden. Somit konnte zum ersten Mal für ein murines Kandidatengen, das in den SCCx43KO Mäusen identifiziert wurde, eine Rolle für die Spermatogenese und Spermatogenesestörungen des Menschen nachgewiesen werden und dadurch das SCCx43KO Mausmodell als translationales Mausmodell zur Erforschung der männlichen Unfruchtbarkeit und der Ermittlung von Kandidatengenen, die auch mit der Entwicklung testikulärer Keimzelltumoren in Verbindung gebracht werden können, bestätigt werden.

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Hilbold, E.A., 2020. Elucidation of molecular mechanisms by which deletion of connexin 43 in Sertoli cells prevents murine spermatogenesis, and investigation of the murine candidate gene Dmrtb1 in human testis showing normal and impaired spermatogenesis. Hannover.
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