Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Pathomechanismen der angeborenen Immunantwort bei viralen Infektionskrankheiten und im Rahmen der Iktogenese

Gerhauser, Ingo

Die angeborene Immunantwort stellt die erste Hürde dar, die Infektionserreger überwinden müssen, um eine Krankheit auszulösen. Das Typ I Interferon (IFN)-System spielt eine wichtige Rolle bei der Abwehr viraler Infektionserkrankungen, deren Bedeutung aufgrund klimatischer Veränderungen und der Globalisierung zugenommen hat. Im zentralen Nervensystem (ZNS) beruht die angeborene Immunantwort aufgrund organspezifischer Besonderheiten wie der Blut-Hirn-Schranke auf ortsständigen Gliazellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die protektiven Mechanismen der angeborenen Immunantwort im Verlauf der Hundestaupe, der Influenza und der Theilerschen murinen Enzephalomyelitis untersucht, die die Virusreplikation begrenzen. Außerdem wurden pathologische Mechanismen studiert, die bei überschießenden Immunreaktionen zu strukturellen Schäden und funktionellen Störungen im Gehirn und Rückenmark führen können. Schlussendlich wurden neue Therapieansätze einer Tollwutvirusinfektion in einem Mausmodell getestet. IRF-3 und IRF-7 sind essentiell für die Bildung von Typ I IFNs in vivo, welches durch die Verwendung von mit Influenzaviren infizierten Knockoutmäusen belegt wurde. Microarray-Analysen zeigten auch eine Hochregulation dieser beiden Transkriptionsfaktoren im Verlauf der drei untersuchten Viruserkrankungen. Bei der Untersuchung von mit dem Theilervirus infizierten SJL- und C57BL/6-Mäusen wurden Unterschiede zwischen diesen Mausstämmen in der intrinsischen Expression von durch Typ I IFN stimulierten Genen (ISGs) festgestellt, die wahrscheinlich in einem kausalen Zusammenhang mit der jeweiligen Empfänglichkeit für eine Viruspersistenz stehen. Gleichermaßen deutet die starke Expression von ISGs in den Satellitenzellen kaniner Dorsalwurzelganglien auf eine antivirale Funktion dieser Zellen hin, die über die bereits beschriebene Rolle als antigenpräsentierende Zelle hinausgeht. Interessanterweise wurde sowohl bei der Staupevirus- als auch der Theilervirusinfektion eine starke Hochregulierung von ISGs nachgewiesen, obwohl nur geringe Mengen an Typ I IFNs gebildet wurden. Dementsprechend werden wahrscheinlich alternative möglicherweise von IRF-1-abhängige Signalwege benutzt, die die Produktion antiviraler ISGs trotz der Hemmung des Typ I IFN-Signalweges durch spezifische Virusfaktoren sicherstellen. Im Gehirn von C57BL/6-Mäusen fanden sich nach einer Theilervirusinfektion starke Entzündungsprozesse, die einerseits zur Viruselimination beitragen andererseits aber auch zu akuten Krampfanfällen führen können. Das Auftreten der Anfälle korrelierte mit einer gesteigerten Mac-3-Expression im Hippokampus, welche auf eine Infiltration von Makrophagen und/oder Proliferation der Mikroglia zurückgehen kann, während die neuronalen Verluste und infiltrierenden Lymphozyten anscheinend kaum zur Entstehung von Krampfanfällen beitragen. Die Rolle der Makrophagen und Mikroglia wurde mit Hilfe einer pharmakologischen Depletion dieser beiden Zelltypen genauer studiert. Die Untersuchungsergebnisse sprechen dafür, dass die Mikroglia zwar für die Begrenzung der Virusreplikation notwendig, jedoch auch an der neuronalen Degeneration beteiligt ist, indem sie große Mengen an TNF-α produziert. Demgegenüber tragen die Makrophagen durch ihre IL-6 Bildung offenbar wesentlich zu den Krampfanfällen bei. Zudem korrelierte die Expression von ISG-15 mit dem Auftreten von Anfällen, was auf eine Beteiligung des Typ I IFN-System an der Entstehung der Krampfanfälle hindeutet. Der Einsatz von Knockoutmäusen zeigte, dass die durch CCR-2 und CX3CR-1 vermittelten Signalwege die Virusreplikation und neuronale Degeneration fördern. Allerdings verminderte das Fehlen dieser beiden Chemokinrezeptoren nicht die Anfallshäufigkeit. Die Apoptose stellt eine Möglichkeit dar, die Virusreplikation in infizierten Zellen zu verhindern. Bei der Theilervirusinfektion kann der apoptotischer Zelltod von Oligo-dendrozyten aber auch zur Initiation der charakteristischen Entmarkungsprozesse bei SJL-Mäusen beitragen. Diese Mäuse wiesen eine gesteigerte intraläsionale Expression von ISG-15 und PKR auf, die möglicherweise die Entzündung verstärkt. Zudem wurde im Rückenmark der SJL-Mäuse eine Aktivierung des Inflammasom-Signalweges festgestellt, der durch das Protein ASC und das Enzym Caspase-1 vermittelt wird und zu einer Freisetzung des pro-inflammatorischen Zytokins IL-1β führt. Die Expression von ISGs wie PKR sowie von Caspase-1 kann durch STAT-1- und IRF-1-abhängige Signalwege induziert werden, welche wiederum von IFN-γ ausgelöst werden können. IFN-γ kann auf diese Weise auch die Apoptose von Oligodendrozyten sowie eine astrozytäre Differenzierung von Oligodendrozyten-vorläuferzellen begünstigen und somit den Demyelinisierungsprozess bzw. die Astrogliose fördern. Weiterhin deuten die durchgeführten Untersuchungen darauf hin, dass die Pyroptose, eine weitere Form des programmierten Zelltodes, zu der entzündungsbedingten Entmarkung beiträgt. Inflammasom-abhängige Entzündungen finden sich auch bei der Influenza. Im Rahmen dieser Arbeit zeigte sich bei mit Influenzaviren infizierten Mäusen eine c-Jun-N-terminale Kinase (JNK)-abhängige Induktion von pro-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen, die zu einer starken Infiltration der Lunge mit neutrophilen Granulozyten führten, während die Anzahl an infiltrierenden T-Zellen reduziert war. Dementsprechend können die Schäden am Lungenparenchym bei einer Influenzavirusinfektion nicht nur direkt viral bedingt sein, sondern auch auf reaktive Entzündungsprozesse zurückgehen. In einer weiteren Influenza-Studie, die während dieser Arbeit durchgeführt wurde, stellte sich heraus, dass die freigesetzten Zytokine in das ZNS eindringen und dort die ortsständige Mikroglia aktivieren können. Hierdurch kommt es zu einer Abnahme der Dornenfortsätze an den Dendriten hippokampaler Neurone, wodurch die Langzeitpotenzierung, das Lernvermögen und die räumliche Gedächtnisbildung beeinträchtigt werden. Eine Restitution dieser Veränderungen lag bei der Maus erst nach 120 Tagen vor, so dass länger anhaltende kognitive Störungen, die vereinzelt bei einer Influenzavirusinfektion auftreten, durch die nachgewiesenen Zytokin-vermittelten Prozesse erklärt werden können. Bei der Tollwut handelt es sich um eine insbesondere in Entwicklungsländern vorkommende Viruserkrankung, die nach dem Auftreten zentralnervöser Symptome nahezu immer tödlich verläuft. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue immunmodulatorische Therapieansätze der Tollwut an experimentell infizierten Mäusen getestet. Zur Hemmung des Inflammasom-Signalweges wurden ein Caspase-1- oder ein IL-1β-Antagonist intrakranial appliziert. Die mit Tollwutvirus infizierten Mäuse zeigten eine längere Überlebenszeit nach einer Caspase-1- aber nicht nach einer IL-1β-Hemmung. Die Gabe der beiden Antagonisten hatte keinen Einfluss auf die Virusreplikation. Somit geht die Verlängerung der Überlebenszeit wahrscheinlich auf die Hemmung der entzündlichen Prozesse im Gehirn zurück. Da trotz der Behandlung alle Tiere innerhalb von zwei Wochen verstarben, wurde in einem weiteren Experiment eine parenterale Kombinationstherapie mit mehreren antiviralen und immunmodulatorischen Substanzen über einen Zeitraum von acht Tagen durchgeführt. Leider verlängerte diese Behandlung ebenfalls lediglich die Überlebens-zeit der infizierten Tiere um bis zu 48 Stunden, was möglicherweise auf eine geschlossene Blut-Hirn-Schranke mit nur geringem Übertritt der applizierten Pharmaka ins Gehirn zuzuführen ist. Dementsprechend kann zwar die Behandlung der Tollwut durch die benutzte Kombinationstherapie verbessert werden, jedoch werden weitere Studien benötig, um die therapeutischen Einsatz der einzelnen Substanzen zu optimieren. Zusammengefasst zeigen diese Untersuchungen, dass die Produktion antiviraler ISGs trotz unterdrückter Typ I IFN-Expression zumindest teilweise durch andere Signalwege sichergestellt werden kann. Bei der Bekämpfung viraler Infektionskrankheiten können die Mechanismen der angeborenen Immunantwort schwere Läsionen im ZNS mit Funktionsstörungen verursachen, die aufgrund der Wirkung von Zytokinen auf die Mikroglia selbst bei Infektionen peripherer Organe auftreten können. Somit stellt die Modulation dieser Mechanismen einen vielversprechenden Therapieansatz viral bedingter Erkrankungen dar.

The innate immune response represents the first barrier against infectious agents thereby protecting a host from contagious illness. The type I interferon (IFN) system plays an important role in the defense against viral infectious diseases, which demand an increasing attention due to climatic changes and globalization. The innate immune response of the central nervous system (CNS) differs from other organs in several features such as the blood-brain-barrier and mainly relies on resident glial cells. This work investigated the protective mechanisms of the innate immune response, which restrict the replication of canine distemper virus (CDV), influenza viruses and Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV). In addition, pathogenic mechanisms were studied, which can cause structural damage and functional disturbances in the brain and spinal cord by exuberant inflammation. IRF-3 and IRF-7 represent essential factors for the production of type I IFNs in vivo, which was demonstrated by using specific knockout mice infected with influenza viruses. Microarray analyses also showed an up-regulation of these two transcription factors after infection with the three investigated viruses. The present investigation of TMEV-infected SJL and C57BL/6 mice detected differences in their intrinsic expression of type I IFN stimulated genes (ISGs), which are probably related to the susceptibility of these mouse strains to virus persistence. Similarly, a strong ISG expression was found in satellite glial cells of canine dorsal root ganglia, which points to an additional antiviral function of these cells, which have already been described as antigen presenting cells. Interestingly, the present study revealed a strong up-regulation of ISGs during CDV-and TMEV-infection despite low level expression of type I IFNs. Consequently, the production of antiviral ISGs might be mediated by alternative maybe IRF-1-dependent pathways, which counteract the inhibition of type I IFN signaling by specific viral factors. Strong inflammatory processes were found in the brain of TMEV-infected C57BL/6 mice, which on the one hand contribute to viral elimination but on the other hand can induce acute seizures. The occurrence of seizures correlated with the increased expression of Mac-3 in the hippocampus, which can be caused by the infiltration of macrophages into the CNS and/or the proliferation of microglia. In contrast, neuronal loss and infiltrating lymphocytes hardly contribute to the generation of seizures. The role of macrophages and microglia was studied in detail using a pharmacological depletion of both cell types. The findings suggest that although microglia is necessary for limiting viral replication, it is also involved in neuronal degeneration by producing a large amount of TNF-α. In contrast, macrophages contribute significantly to seizure generation by high IL-6 production. Moreover, the expression of ISG-15 correlated with the occurrence of seizures, which indicates an involvement of the type I IFN system in seizure development. The use of knockout mice showed that signaling pathways mediated by CCR-2 and CX3CR-1 promote viral replication and neuronal degeneration. However, the absence of these two chemokine receptors did not diminish seizure frequency. Apoptosis represents one way to prevent the replication of viruses in infected cells. Nevertheless, the apoptotic cell death of oligodendrocytes during TMEV-infection can also contribute to the initiation of the characteristic demyelination processes of SJL mice. These mice also showed an increased intralesional expression of ISG-15 and PKR, which possibly intensifies the inflammation. In addition, an activation of the inflammasome signaling pathway was found in the spinal cord of SJL mice, which was mediated by the protein ASC and the enzyme caspase-1 and results in the release of the pro-inflammatory cytokine IL-1β. The expression of ISGs such as PKR and of caspase-1 can be induced by STAT-1- and IRF-1-dependent signaling pathways, which are themselves triggered by IFN-γ. These pathways also allow IFN-γ to promote the apoptosis of oligodendrocytes and the astrocytic differentiation of oligodendrocyte precursor cells supporting the demyelination process and astrogliosis. Furthermore, the findings of the present investigations indicate that pyroptosis, another form of programmed cell death, contributes to the inflammatory processes during demyelination. Inflammatory processes resulting from an activation of the inflammasome pathway have also been described during influenza virus infections. The present work demonstrated an induction of pro-inflammatory cytokines and chemokines in mice infected with influenza viruses, which was mediated by a c-Jun N-terminal kinase (JNK) and resulted in a strong infiltration of the lung by neutrophilic granulocytes and a decreased number of infiltrating T cells. Therefore, lesions of the lung parenchyma can not only be caused by the virus itself but also by inflammatory processes directed against the virus. Another influenza study included into this work demonstrated that cytokines released during inflammations can enter the CNS and activate the resident microglia. This led to a decreased number of dendritic spines of hippocampal neurons and hence an impaired long term potentiation, spatial learning and memory formation. Full recovery of these changes was not found until 120 days post infection. Consequently, prolonged cognitive disorders, which infrequently occur after influenza virus infections, can be explained by the described cytokine-mediated processes. Rabies is a viral disease most commonly arising in developing countries, which once neurological symptoms appear causes death in almost all infected individuals. This work includes new immunomodulatory therapeutic concepts of rabies, which were tested using experimentally infected mice. A caspase-1 or an IL-1β antagonist was administered intracranially to inhibit the inflammasome pathway. Mice infected with rabies virus showed a longer survival time after caspase-1 but not after IL-1β inhibition. The administration of the two antagonists had no effect on virus replication. Thus, prolonged survival time is likely due to the inhibition of inflammatory processes in the brain. Despite the treatment all animals died within two weeks, which prompted another experiment, in which a parenteral combination therapy with several antiviral and immunomodulatory substances was performed over a period of eight days. Unfortunately, this treatment also only prolonged the survival time of the infected animals by up to 48 hours, which was possibly caused by a closed blood-brain barrier with limited transfer of the administered drugs into the brain. Therefore, although the treatment of rabies can be improved by the used combination therapy, further studies are needed to optimize the therapeutic use of each substance. Summarized these investigations demonstrate, that the production of antiviral ISGs can at least partially be maintained by alternative signaling pathways in case of suppressed type I IFN expression. The mechanisms of the innate immune response can induce severe CNS lesions and functional disturbances when fighting viral infectious diseases, which can even be caused by infections of peripheral organs due to cytokine effects on microglia. Thus, the modulation of these mechanisms represents a promising therapeutic approach for virally induced diseases.

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Gerhauser, Ingo: Pathomechanismen der angeborenen Immunantwort bei viralen Infektionskrankheiten und im Rahmen der Iktogenese. Hannover . DVG.

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