Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen kaniner histiozytärer Neoplasien unter besonderer Berücksichtigung des Tumormikromilieus und des Einsatzes viraler Onkolyse

Puff, Christina

Maligne Neoplasien stellen nach wie vor eine der häufigsten Todesursachen bei Hunden und Menschen dar. Trotz umfangreicher Studien in den letzten Jahren führt bei vielen Tumortypen eine Therapie lediglich zu einer partiellen oder transienten Verbesserung der Erkrankung. Einen derartigen Tumor mit vergleichbar schlechter Prognose bei Hund und Mensch stellt das histiozytäre Sarkom dar. Therapeutisch werden neben chirurgischen Maßnahmen auch chemo- und radiotherapeutische Ansätze bzw. Kombinationen daraus angewandt, die jedoch häufig nur zu einer geringfügigen Verbesserung der Prognose beitragen. Daher besteht nach wie vor ein erheblicher Bedarf an neuen Therapieansätzen. Eine attraktive Möglichkeit stellt dabei die virale Onkolyse dar, bei der sich eine Virusinfektion zunutze gemacht wird, um entweder die neoplastischen Zellen direkt zu zerstören oder aber das Tumormikromilieu derartig zu modifizieren, dass eine Regression oder Wachstumshemmung der Neoplasie hervorgerufen wird. Derzeit werden Viren unterschiedlichster Familien, darunter mehrere Vertreter der Familie Paramyxoviridae, zu denen auch das humane Masernvirus und das kanine Staupevirus gehören, untersucht. Trotz zahlreicher Studien mit vielversprechenden Ergebnissen sind der zugrundeliegende Mechanismus der viralen Onkolyse und die im Tumormikromilieu sowie in den neoplastisch transformierten Zellen ausgelösten Modifikationen noch weitgehend unbekannt. Außerdem fehlt in vielen Fällen eine genaue Charakterisierung bestehender Xenotransplantationsmodelle im Vergleich zu spontanen Neoplasien gleicher Histogenese. Einleitend wird in dieser Habilitationsschrift eine Übersicht über histiozytäre Erkrankungen gegeben, wobei der Schwerpunkt bei kaninen histiozytären Neoplasien liegt. Weiterhin erfolgt eine Betrachtung der Therapie von Tumoren unter besonderer Berücksichtigung der Prognose und Therapie histiozytärer Sarkome. Danach erfolgt ein Überblick über die virale Onkolyse und das kanine Staupevirus. Weiterhin wird eine Übersicht über das Tumormikromilieu mit seinen unterschiedlichen Bestandteilen wie der extrazellulären Matrix, den Gefäßen und infiltrierenden Entzündungszellen dargestellt. Anschließend wird ein Überblick über Tumorinvasion und –metastasierung gegeben. Die dieser Habilitationsschrift zugrundeliegende Intention bestand in einer detaillierten Analyse des Einflusses einer kaninen Staupevirusinfektion auf kanine histiozytäre Sarkome in vitro und in vivo sowie der Untersuchung weiterer Therapieansätze für histiozytärer Neoplasien. Darüber hinaus sollten, als Basis für weitere pathogenetische Untersuchungen benötigte, in vitro und in vivo bestimmte, Grundlagen der Variabilität zellkultureller Untersuchungen und der kaninen Staupevirusinfektion bestimmt werden. Die neun in dieser Habilitationsschrift zusammengefassten Publikationen lassen sich drei Bereichen zuordnen: 1. Untersuchung des Tumormikromilieus bei spontanen und xenotransplantierten kaninen histiozytären Neoplasien einschließlich der Charakterisierung der passagenabhängigen Veränderungen kaniner histiozytärer Sarkomzellen sowie der Staupevirus-assoziierten Modulationen kaniner histiozytärer Sarkomzellen und des Tumormikromilieus 2. Vergleichende Darstellung grundlegender Informationen zur Pathogenese der kaninen Staupevirusinfektion und zu viraler Onkolyse unter besonderer Berücksichtigung von Morbilliviren 3. Darstellung neuartiger therapeutischer Ansätze für histiozytäre Tumoren Kanine histiozytäre Sarkomzellen (DH82-Zellen) zeigen bei einem in vitro-Vergleich nicht infizierter mit persistierend infizierten DH82-Zellen auf Transkriptomebene eine Regulation zahlreicher Gene. Dabei zeigte sich, dass infolge der Virusinfektion insbesondere Gene aufreguliert waren, die mit der Induktion einer Immunantwort assoziiert werden. In diesem Zusammenhang muss beachtet werden, dass die Expression der Oberflächenmoleküle CD11c, CD14, CD18, CD45 und CD80 bei hohen Passagen nicht-infizierter DH82-Zellen geringer als bei niedrigen Passagen war, woraus möglicherweise eine funktionell geringere Aktivierung der Immunantwort resultieren könnte. Dies ist daher bei funktionellen Untersuchungen, insbesondere bei mit Xenotransplantationen verbundenen Tiermodellen, zu beachten. Eine durch die neoplastischen Zellen induzierte Immunantwort konnte in vivo sowohl in einem murinen Xenotransplantationsmodell mit subkutaner Applikation von DH82-Zellen als auch bei spontanen histiozytären Sarkomen beobachtet werden. Es fanden sich in beiden Fällen intratumoral Makrophagen, die als Tumor-assoziierte Makrophagen (TAMs) bezeichnet werden. Des Weiteren konnte im murinen Modell gezeigt werden, dass diese TAMs eine Quelle für Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) darstellen. Diese Proteine sind wichtige Modulatoren der extrazellulären Matrix und können sowohl pro- als auch antitumorale Funktionen ausüben. Neben den TAMs exprimierten sowohl die neoplastischen Zellen spontaner histiozytäre Sarkome als auch diejenigen der Xenotransplantate MMPs. Dabei war die Expression in beiden Fällen im Tumorzentrum geringer als in der Tumorperipherie. Auch kanine kutane Histiozytome, die zumeist eine spontane Regression aufweisen, zeigten im Tumorzentrum eine geringere MMP-Expression als in der Tumorperipherie, so dass die pathogenetische Bedeutung der MMP-Expression mittels der durchgeführten Untersuchungen nicht abschließend geklärt werden konnte. Auf Transkriptomebene zeigten persistierend Staupevirus-infizierte DH82-Zellen in vitro eine starke Herunterregulierung von Genen, die mit Angiogenese assoziiert werden. Interessanterweise ergab sich bei der funktionellen Untersuchung dieses Ergebnisses im murinen Xenotransplantationsmodell ebenfalls eine signifikant geringere intratumorale Gefäßdichte bei persistierend infizierten Tumoren im Vergleich zu nicht infizierten Neoplasien. Klinisch verhielten sich nicht-infizierte und persistierend Staupevirus-infizierte Transplantate in der Frühphase gleich. Im weiteren Verlauf wiesen die nicht-infizierten Tumoren jedoch ein kontinuierliches Wachstum auf, wohingegen persistierend Staupevirus-infizierte Neoplasien eine komplette Spontanregression zeigten. Diese Befunde sprechen dafür, dass die intratumorale Gefäßversorgung einen wichtigen Mechanismus der viralen Onkolyse unter Verwendung des kaninen Staupevirus darstellt. Für die intratumorale Gefäßversorgung wird eine Modifikation des Tumormikromilieus benötigt an der MMPs beteiligt sind. Im vorliegenden murinen Modell konnte gezeigt werden, dass die MMP-14-Expression mit der intratumoralen Gefäßdichte korrelierte, so dass eine Reduktion dieser Expression mit einer verminderten Umstrukturierung der angrenzenden extrazellulären Matrix und damit einhergehend zu einer verminderten Vaskularisierung, Invasion und Metastasierung dieser Tumoren beitragen könnte. Für die Freisetzung von MMPs, bzw. deren Transport zur Zellmembran werden weitreichende Umstrukturierungen des Zytoskeletts benötigt. Einen Bestandteil des Zytoskeletts stellt Cortactin dar. Bemerkenswerterweise konnte in vitro gezeigt werden, dass eine persistierende Staupevirusinfektion von DH82-Zellen mit einer verminderten Anzahl an Cortactin mRNA-Transkripten, einer reduzierten Expression von Cortactin an der Zellmembran und einer geringeren Migrationsgeschwindigkeit einherging, so dass dies ebenfalls einen interessanten therapeutischen Ansatzpunkt darstellt. Zusammenfassend handelt es sich bei der kaninen Staupevirusinfektion histiozytärer Sarkomzellen um einen Prozess, der wahrscheinlich die Tumorprogression, -invasion und –metastasierung auf verschiedene Weise hemmt und darüber hinaus über eine Hemmung der Angiogenese und eine Aktivierung der Immunantwort einen vielversprechenden Ansatzpunkt zur Entwicklung neuartiger Therapien derartiger Tumoren darstellt. Das kanine Staupevirus kann neben oben angegebenen histiozytären Zellen zahlreiche weitere Zelltypen infizierten, so dass abgesehen von histiozytären Neoplasien auch ein Einsatz bei Tumoren anderer Histogenese denkbar ist. Abgeleitet von der Pathogenese spontaner kaniner Staupevirusinfektionen könnte dies beispielsweise für Tumoren ausgehend vom lymphatischen Gewebe oder des zentralen Nervensystems, insbesondere Astrozytome gelten. Zukünftig könnte die onkolytische Wirkung des kaninen Staupevirus auf kanine histiozytäre Sarkome aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit dadurch potenziert werden, dass durch genetische Modifikationen des Virus eine Verstärkung der Angiogenesehemmung hervorgerufen und / oder eine verstärkte anti-tumorale Immunantwort induziert wird.

Malignant neoplasms are still one of the most common causes of death in dogs and humans. Despite extensive research during the last years, therapeutic approaches only lead to a transient or partial response in many cases. One example of such tumors with a comparable poor prognosis in dogs and humans represents the canine histiocytic sarcoma. Treatments comprise surgery as well as chemo- and radiotherapy or combinations of the aforementioned. Unfortunately they often improve the prognosis only marginally. Therefore new therapeutic approaches are highly appreciated. One attractive possibility represents viral oncolysis, for which viruses are used to destroy the neoplastic cells themselves or to modify the tumor microenvironment with the result of a regression or growth retardation of the neoplasms. Currently many viruses of different families including multiple agents of the family Paramyxoviridae, which includes the human measles and the canine distemper virus, are under consideration. Despite many studies with promising results, the underlying mechanisms of viral oncolysis and the resulting modifications within neoplastic cells and the tumor microenvironment are largely unknown. Furthermore, many xenotransplantation models lack a proper characterization in comparison to their spontaneously occurring counterparts of the same histogenesis. Within the introductory section of the thesis an overview about histiocytic diseases is given, which focuses on canine histiocytic tumors. Furthermore therapeutic approaches and prognosis of neoplasms with special emphasis on histiocytic sarcomas are described. Subsequently, an outline of viral oncolysis and canine distemper virus are given. Additionally, the tumor microenvironment including its components like extracellular matrix, vessels and infiltrating immune cells is detailed. Finally, an overview about tumor invasion and metastasis is provided. The aim of the present work was to analyze the impact of a canine distemper virus infection on canine histiocytic sarcomas in vitro and in vivo. Furthermore, an evaluation of therapeutic approaches for or using histiocytic cells was performed. Additional in vitro and in vivo investigations focused on the variability of cell culture studies and canine distemper virus infection as a preliminary basis for further pathogenetic analyses. The nine publications summarized in this thesis can be attributed to three research topics: 1. Investigations of the tumor microenvironment of spontaneous and xenotransplanted canine histiocytic neoplasms including characterization of passage dependent variations of canine histiocytic sarcoma cells as well as canine distemper virus associated modulations of canine histiocytic sarcoma cells and the tumor microenvironment 2. Comparative outline of basic principles in the pathogenesis of canine distemper virus infection and viral oncolysis with special emphasis on morbilliviruses 3. Characterization of innovative therapeutic approaches for histiocytic tumors Persistently canine distemper virus infected canine histiocytic sarcoma cells (DH82 cells) exhibited a marked variation of the expression of numerous genes on a transcriptional level when compared to non-infected cells. They namely displayed an upregulation of genes, which are associated with the induction of an immune response. In this context, it has to be taken into consideration, that the expression of the cell surface molecules CD11c, CD14, CD18, CD45 and CD80 was lower in high passages of DH82 cells compared lo low passes, which might result in a functionally reduced activation of the immune response. This is especially important for functional analyses such as xenotransplantation models. An immune response triggered by neoplastic cells was seen in both, the murine xenotransplantation model with subcutaneous application of DH82 cells and spontaneous histiocytic sarcomas. In both cases, intratumoral macrophages, which are named tumor-associated macrophages (TAMs), could be demonstrated. Furthermore, it was shown, that these TAMs were a source for matrix metalloproteinases (MMPs) in the murine xenotransplantation model. These proteins are important modulators of the extracellular matrix, which can function pro- and antitumorally. Beside TAMs, neoplastic cells of spontaneous canine histiocytic sarcomas and xenotransplanted tumors also expressed MMPs. In both cases, the expression was lower in the tumor center compared to the periphery of the neoplasm. Likewise, canine cutaneous histiocytomas, which regress spontaneously in most cases, displayed a lower MMP expression in the tumor center compared to the periphery. Therefore, the pathogenetic impact of the MMP expression could not be finally elucidated. Furthermore, persistently canine distemper virus-infected DH82 cells displayed a marked down-regulation of genes, which are associated with angiogenesis compared to non-infected cells. Interestingly, this could be verified in vivo in the xenotransplantation model, where persistently canine distemper virus infected neoplasms contained significantly smaller numbers of blood vessels than non-infected tumors. Clinically, the initial growth curve of non-infected and persistently canine distemper virus infected transplants was similar. In later stages, non-infected neoplasms grew continuously while persistently canine distemper virus infected tumors exhibited a complete regression. These findings indicate that the lack of the intratumoral blood supply represents an important mechanism of viral oncolysis using canine distemper virus infection. The intratumoral blood supply requires a modification of the tumor microenvironment which is in part caused by MMPs. In the present murine model, a correlation of the MMP-14 expression and the intratumoral vessel density was found. This indicates that a reduction of this expression might lead to a decreased modulation of the adjacent extracellular matrix resulting in an inhibition of vascularization, invasion and metastasis of this neoplasm. The liberation of MMPs and their transport to the cell membrane, respectively, require extensive modifications of the cytoskeleton. Cortactin is a part of the cytoskeleton. Remarkably, a persistent canine distemper virus infection of DH82 cells led to a reduced number of cortactin mRNA transcripts, a decreased expression of cortactin along the cell membrane and a lower migration capacity of these cells compared to non-infected controls, rendering these results an interesting finding for further therapeutic approaches. The canine distemper virus is able not only to infect histiocytic cells but also many other cell types. Therefore a therapeutic benefit might also exist for neoplasms of different histogenesis. With respect to the pathogenesis of spontaneous canine distemper virus infections, this might be the cause for neoplasms originating from lymphoid organs or central nervous system, especially astrocytomas. In summary, canine distemper virus infection of histiocytic cells leads to an inhibition of tumor growth, invasion and metastasis by multiple mechanisms. Furthermore, due to inhibition of angiogenesis and activation of an immune response, it represents an interesting starting point for novel therapeutic approaches for such neoplasms. The results of the present study imply that the oncolytic effect of canine distemper virus on canine histiocytic sarcomas might be potentiated by genetic modifications of the virus leading to an enhancement of angiogenesis inhibition and / or an increased anti-tumoral immune reaction in the future.

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Puff, Christina: Untersuchungen kaniner histiozytärer Neoplasien unter besonderer Berücksichtigung des Tumormikromilieus und des Einsatzes viraler Onkolyse. Gießen 1. Auflage 2019 2019. DVG.

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