Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Phänotypische und molekulare Charakterisierung von Astrozyten bei der demyelinisierenden Staupeenzephalitis des Hundes

Klemens, Johanna Annette

In der Literaturübersicht wird neben der Klassifikation von Morbilliviren und deren Wirtsspektrum ein Überblick über das kanine Staupevirus (CDV) und die Pathogenese der CDV-Infektion, insbesondere der demyelinisierenden Leukoenzephalitis als häufigste Manifestationsform im ZNS, gegeben. Da diese als spontanes Tiermodell für die multiple Sklerose des Menschen dient, erfolgt eine Erläuterung weiterer Tiermodelle, die für die Erforschung dieser Erkrankung genutzt werden. Ein besonderes Augenmerk wird auf Astrozyten als Hauptzielzelle des Staupevirus gelegt. Die verschiedenen Markermoleküle zur Identifizierung dieses Zelltyps inklusive deren Spezifität werden erläutert. Es wird auf die vielseitigen Funktionen und Eigenschaften von Astrozyten in physiologischen und pathologischen Zuständen eingegangen und eine Übersicht über den bisherigen Wissensstand zu reaktiven Astrozyten bei verschiedenen ZNS-Erkrankungen und deren Polarisierung in neurotoxische oder neuroprotektive Phänotypen (A1/A2-Polarisierung) gegeben. Ziele der vorliegenden Studie waren es, phänotypische Veränderungen von Astrozyten bei der demyelinisierenden Staupeenzephalitis mittels Immunhistologie zu charakterisieren und das astrozytäre Genexpressionsmuster mittels Genexpressionsanalysen, auch hinsichtlich einer Polarisierung zu A1- oder A2-Astrozyten, zu untersuchen. Für die Untersuchung stand Formalin-fixiertes und Paraffin-eingebettetes Klein- und Stammhirngewebe von insgesamt 5 nicht-infizierten Kontrolltieren und 29 Staupevirus-infizierten Hunden zur Verfügung. Die Einteilung der Gewebsläsionen in vier Gruppen erfolgte anhand Hämatoxylin-Eosin- und Luxol Fast Blue/Kresylechtviolett-gefärbten Schnitten zur Darstellung pathomorphologischer Veränderungen und des Demyelinisierungsgrades. In Gruppe 1 wurden Kontrolltiere zusammengefasst, während durch die Gruppen 2 – 4 unterschiedliche Stadien der Staupeläsionen eingeteilt wurden: Gruppe 2 enthielt akute Läsionen, die durch eine Vakuolisierung und Gliose der weißen Substanz charakterisiert waren. Subakute Läsionen der Gruppe 3 zeigten einen Myelinverlust mit Nachweis von Gitterzellen, Gemistozyten und einzelnen Lymphozyten. Zusätzlich zu den Veränderungen dieser Gruppe wiesen subakute bis chronische Läsionen der Gruppe 4 perivaskuläre, entzündliche Infiltrate auf. Mittels Immunhistologie wurden Marker für reife Oligodendrozyten (Nogo-A), basisches Myelinprotein (MBP) und Staupevirus-Nukleoprotein zur Bestätigung des Myelinverlusts und zum Virusantigen-Nachweis verwendet. Zur Phänotypisierung astrozytärer Veränderungen wurden verschiedene Astrozytenmarker (saures Gliafaserprotein [GFAP], Aquaporin 4 [AQP4], Aldehyddehydrogenase 1 L1 [ALDH1L1], Glutamin-Synthetase [Gl Syn], S100, Survivin) untersucht. Bereits in der Frühphase der Infektion kam es zu einer reaktiven Astrogliose, charakterisiert durch einen Anstieg an GFAP+ Zellen, die mehrheitlich eine gemistozytäre Morphologie aufwiesen. Eine veränderte Anzahl ALDH1L1+ Zellen konnte nicht beobachtet werden. Es wurde eine verminderte Expression des Wasserkanalproteins AQP4 und des Glutamat-abbauenden Enzyms Gl Syn in allen CDV-Läsionsgruppen beobachtet, die auf eine Störung der Blut-Hirn-Schranken-Integrität und des Glutamatmetabolismus hinweist. Der Verlust von S100+ Astrozyten spielt möglicherweise eine Rolle bei der Viruspersistenz im ZNS und trägt durch Fehlen der neuroprotektiven Eigenschaften zu neuronaler Schädigung bei. Die Aufregulation des anti-apoptotischen Markers Survivin weist auf eine Apoptose-Resistenz von Astrozyten in CDV-Läsionen hin. In einem weiteren Teil der Studie wurden mittels Genexpressionsanalysen Veränderungen im astrozytären Expressionsmuster untersucht. Dabei wurde ein Datensatz von 81 Astrozyten-assoziierten Genen generiert, die im Rahmen der CDV-Infektion differenziell exprimiert werden. Diese Gene wurden basierend auf ihren Expressionswerten mittels hierarchischer Clusteranalysen in vier Cluster eingeteilt. Cluster A umfasste 14 Gene mit verminderten Expressionswerten, unter denen sich mehrere Gene fanden, die in die Detoxifizierung von Glutamat involviert sind. Eine Störung des Glutamatmetabolismus kann exzitotoxische Akkumulationen des Neurotransmitters bewirken, die zu neuronalem und oligodendroglialem Zelltod führen. Die deutliche Mehrheit der differenziell exprimierten Gene wies eine gesteigerte Expression auf. Die Gene wurden anhand des Grades der Aufregulation in Cluster B, C und D unterteilt. Durch Zuordnung von statistisch angereicherten Gene ontology (GO)-Termini wurde gezeigt, dass aufregulierte Gene an Apoptose, Entwicklungsprozessen, Zellproliferation, Signaltransduktion und Aktivierung der Immunantwort beteiligt sind. Die Untersuchungen zur Astrozytenpolarisation zeigten eine Dominanz von Genen, die mit dem neurotoxischen A1-Phänotyp assoziiert sind. Zur Bestätigung der Ergebnisse aus den Genexpressionsanalysen wurde ein immunhistologischer Nachweis der Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) und des A1-spezifischen Markers C3 inklusive einer Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung an ausgewähltem Gefriermaterial durchgeführt. Dadurch wurde die Präsenz C3+/GFAP+ A1-Astrozyten in fortgeschrittenen Stadien der CDV-Infektion bestätigt. Die Aufregulation des immunmodulatorischen Enzyms IDO führt im ZNS zur Produktion neurotoxischer Metabolite, die möglicherweise zum Fortschreiten von Krankheitsprozessen bei demyelinisierenden ZNS-Erkrankungen beitragen. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Studie, dass reaktive Astrozyten schon in frühen Phasen der Staupevirus-induzierten Enzephalitis auftreten und durch eine Maladaptation zu Störungen der Blut-Hirn-Schranken-Funktionalität und des Glutamatmetabolismus führen. Zudem fördern sie die Aktivierung der Immunantwort und nehmen einen neurotoxischen Phänotyp an, der zur Schädigung von Neuronen und Oligodendrozyten führen kann. Astrozytopathien tragen somit potenziell zur Initiierung und Progression von Krankheitsprozessen bei der demyelinisierenden Staupeenzephalitis bei.

The canine distemper virus (CDV) is a pantropic morbillivirus with a worldwide distribution and a broad host spectrum. The most common manifestation of CDV infection in dogs is demyelinating leukoencephalitis (CDV-DL). CDV-DL serves as spontaneous animal model for human multiple sclerosis. Astrocytes represent the main targets for CDV. They account for trophic support of neurons and oligodendrocytes, maintenance of blood brain barrier integrity, and removal of excitotoxic neurotransmitters in the healthy central nervous system. Recent publications describe the polarization of reactive astrocytes based on their gene expression profile into beneficial and detrimental phenotypes. Astrocytes activated by inflammatory stimuli exhibit a gene expression pattern indicating neurotoxic properties (A1-astrocytes), whereas ischemia induces astrocytes with neuroprotective functions (A2-astrocytes). However, so far, the role of reactive astrocytes in the pathogenesis of CDV-DL has not been investigated in detail. Aims of the present study were to characterize phenotypical changes of astrocytes in CDV-DL by immunohistochemistry and to investigate the astrocytic expression profile by the aid of gene expression analysis. Special emphasis was given to the analysis of astrocyte polarization towards a neurotoxic A1- or neuroprotective A2-phenotype in demyelinating lesions. For the study, formalin-fixed and paraffin-embedded cerebellar and brain stem tissue from five non-infected control animals and 29 CDV-infected dogs was used. Lesions were classified based on morphological criteria using hematoxylin and eosin- and luxol fast blue/cresyl violet-stained slides. Group 1 included control dogs, whereas in group 2 – 4 different stages of CDV lesions were grouped: group 2 comprised acute lesions characterized by vacuolization and gliosis of the white matter. Subacute lesions of group 3 showed myelin loss with gitter cells, gemistocytes and single lymphocytes. Additionally, subacute to chronic lesions of group 4 exhibited perivascular, inflammatory infiltrates. Markers for mature oligodendrocytes (Nogo-A), myelin basic protein (MBP) and CDV-nucleoprotein were used to confirm myelin loss and detect viral antigen by immunohistochemistry. For phenotyping of astrocytic changes, different astrocyte markers (glial fibrillary acidic protein [GFAP], aquaporin 4 [AQP4], aldehyde dehydrogenase 1 L1 [ALDH1L1], glutamine synthetase [Gl Syn], S100, survivin) were applied. Beginning in early phases of infection, reactive astrogliosis, characterized by an increase of GFAP+ cells, was observed. Activated astrocytes mainly show a gemistocytic morphology. Changes in the number of ALDH1L1+ cells were not observed in CDV-DL lesions. Reduced expression of the water channel AQP4 and the glutamate degrading enzyme Gl Syn was detected in all CDV groups, indicating disturbed blood brain barrier integrity and glutamate metabolism, respectively. Loss of S100+ astrocytes potentially plays a role in viral persistence in the CNS and might contribute to neuronal damage by an absence of neuroprotective influence. Upregulation of the anti-apoptotic marker survivin is indicative of astrocytic resistance to apoptosis in CDV lesions. Molecular changes of reactive astrocytes and specific astrocytic expression patterns were determined by gene expression analyses. A database of 81 astrocyte-related genes differentially expressed during CDV-infection was generated. These genes were grouped into four clusters by hierarchical cluster analysis based on their expression values. Cluster A contained 14 downregulated genes, including several genes involved in detoxification of glutamate. Disturbed glutamate metabolism can lead to excitotoxic accumulation of neurotransmitters causing neuronal and oligodendroglial cell death. The majority of differentially expressed genes (DEGs) showed an increased expression in CDV-infected animals. Based on the expression levels, upregulated genes were grouped into cluster B, C and D. Assignment of statistically enriched gene ontology terms revealed involvement of upregulated DEGs in apoptosis, developmental processes, cell proliferation, signal transduction, and activation of the immune response. Moreover, a dominance of genes associated with neurotoxic A1-polarized astrocytes was detected. Accordingly, the presence of C3+ A1-astrocytes in advanced lesions of CDV-DL was shown by immunohistochemistry. Complement component C3+/GFAP+ cells, characteristic of A1-astrocytes, were found in demyelinating lesion also by immunofluorescence. In addition, immunohistochemical detection of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) was performed to confirm gene expression data. Upregulation of the immune modulatory enzyme IDO leads to production of neurotoxic metabolites in the CNS, potentially contributing to disease progression in demyelinating CNS disorders. In conclusion, results of the present study show that reactive astrocytes occur already in early phases of CDV-induced encephalitis. Astrocytic maladaptation might lead to disturbance of blood brain barrier function and glutamate metabolism. Additionally, astrocytes activate immune responses and polarize towards a neurotoxic phenotype, which has the potential to cause neuronal and oligodendroglial cell damage. Thus, astrocytopathies potentially contribute to the initiation and progression in CDV-induced demyelinating leukoencephalitis.

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Klemens, Johanna: Phänotypische und molekulare Charakterisierung von Astrozyten bei der demyelinisierenden Staupeenzephalitis des Hundes. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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