Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Generation and characterization of antibodies against Rift Valley fever phlebovirus and evaluation of their therapeutic efficacy in a mouse model

Gutjahr , Benjamin

Das Rifttal-Fieber-Virus (Rift Valley fever phlebovirus, RVFV) ist ein von Stechmücken (Culicidae) übertragener Erreger innerhalb der Ordnung Bunyavirales, der schwere Erkrankungen bei Mensch und Tier auslöst. Auch wenn die Mehrheit der Menschen nur eine selbstlimitierende Fiebererkrankung durchläuft, können in 1-2 % der Fälle schwere Verläufe auftreten. Sie umfassen Retinitis, neurologische Störungen und schwere Hepatitiden mit einem oft tödlich verlaufenden hämorrhagischen Fieber. Besonders empfänglich sind kleine Wiederkäuer bei denen in infizierten Muttertieren typische massenhafte Verlammungen (sog. „abortion storms“) auftreten können. Der Mensch wird im Gegensatz zu Tieren hauptsächlich über infizierte Tiere, vor allem aber durch viruslastiges Tiergewebe und nur selten direkt von Stechmücken infiziert. Aufgrund einer hohen Vektor-Kompetenz hat sich das Virus in den letzten Jahrzehnten über weite Teile Afrikas, die angrenzenden Inseln und die Arabische Halbinsel ausgebreitet und stellt ein enormes globales Gesundheitsrisiko dar. Das Virus verursacht wiederholt Ausbrüche auf dem gesamten Kontinent mit einer hohen Zahl an betroffenen Menschen und Tieren mit schwerwiegenden sozioökonomischen Folgen.Gegenwärtig gibt es keine spezifische Therapie gegen das RVFV doch stellen Antikörper vielversprechende Kandidaten für prophylaktische und therapeutische Behandlungen dar. Ziel der Arbeit war daher neue und neuartige Antikörper gegen RVFV zu generieren, zu charakterisieren und als mögliche Therapeutika in Infektionsstudien einzusetzen. In einer ersten Studie (Manuskript I) wurden Einzeldomänenantikörper (sdAb) gegen RVFV durch die Immunisierung eines Alpakas (Vicugna pacos) mit RVFV gewonnen. Nach Isolierung und Amplifikation entsprechender Antikörpersequenzen in einer Phagenbibliothek konnte mit Hilfe eines neuen Selektionsverfahrens via Immunfluoreszenztest (IIFA) eine antigenbindende Domäne (VHH) identifiziert werden, die eine starke Bindung an das Nukleoprotein (Np) des Virus aufweist. Der 15 kDa große Antikörper zeigte zudem eine hohe Reaktivität in nanomolarer Konzentration für phylogenetisch verschiedene RVFV-Stämme in dem IIFA. Der neu gefundene sdAb eignet sich daher als neues Diagnosewerkzeug für die Detektion und Visualisierung des Np Proteins. Das angewendete Protokoll soll nun im Rahmen zukünftiger Screenings für die Gewinnung von sdAb vor allem gegen die viralen Glykoproteine eingesetzt werden, die als aussichtsreiche neutralisierende Antikörper-Kandidaten für mögliche therapeutische Behandlungen gelten. Der Hauptteil (Manuskript II) beschäftigte sich mit der therapeutischen Evaluierung von zwei murinen monoklonalen Antikörpern (mAbs) in einem Mausinfektionsmodell für das Rifttal-Fieber-Virus. Beide Antikörper (Gn3 und Gn32) wurden durch die Immunisierung mit rekombinanten Gn Protein hergestellt, wobei Gn3 neutralisierende Aktivität aufweist. Durch Ko-inkubation mit Gn32 konnte eine signifikant höhere Aktivität erzielt werden, die sich auf kooperative Effekte zurückführen lässt. Anschließend wurden RVFV-infizierte Mäuse durch Zugabe von Gn3 allein oder in Kombination mit Gn32 im Rahmen einer Präexpositions- und einer Postexpositionsprophylaxe behandelt. Die Anwendung von Gn3 allein und in Kombination führten zu einer höheren Überlebensrate im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe. Nachfolgende Analysen mittels PCR, Virustitration und Immunhistochemie zeigten eine Reduktion der Viruslast in allen Geweben, die in den Kombinationsgruppen signifikant war. Die kombinierte Anwendung von Gn3 und Gn32 als Postexpositionsprophylaxe zeigte dabei einen vollständigen Schutz (100 %ige Überlebensrate). Damit konnten wir erstmals nachweisen, dass eine Behandlung mit murinen monoklonalen Antikörpern vollständig vor einer RVFV-Infektion schützen kann. In einer letzten Studie (Manuskript III) wurden neue monoklonale Antikörper durch Immunisierung von Mäusen mit dem Impfstamm MP-12 oder dem virulenten RVFV-Stamm 35 / 74 gewonnen. Die unterschiedlichen Impfregime führten zu hohen neutralisierenden Titern bei Mäusen, die die Erzeugung von 14 neuen anti-RVFV mAbs ermöglichten. Mit allen Antikörpern kann das Virus in infizierten Zellen mittels indirekter Immunfluoreszenz nachgewiesen werden. Bei einem einzelnen mAb wurde Reaktivität gegenüber rekombinantem Np in einem ELISA festgestellt. Die anderen mAbs erkennen vermutlich konformationsabhängige oder diskontinuierliche Epitope. Ein einzelner Klon zeigte zudem im Serumneutralisationstest eine geringe neutralisierende Wirkung, die ihn zu einem zusätzlichen therapeutischen Kandidaten macht.

Rift Valley fever phlebovirus (RVFV) is one of the most important pathogens of the genus Phlebovirus as it causes severe diseases in humans and livestock. While the majority of infected humans only suffers from a self-limiting febrile disease, severe progression can occur in 1-2 % of cases, often with retinitis and neurological disorders or even as fatal hemorrhagic fever syndrome due to severe hepatitis. Ruminants are the most susceptible animals among livestock where RVFV can provoke so-called abortion storms and mortality rates in newborn animals of up to 100 %, while adult animals usually only suffer from subacute fever symptoms. Humans are primarily infected due to contact to infectious tissues and fluids from viremic animals and only rarely by mosquitos. RVFV has spread in the last decades to many African countries, its adjacent islands and to the Arabian Peninsula and has caused repeated outbreaks throughout the continent, thereby effecting major socio-economic losses. Moreover, given climate changes and the global trade of animals and goods, RVFV may even spread to Europe and is therefore a feasible emerging disease threat. To date there is no approved human vaccine and no therapy available. Antibodies are promising candidates for prophylactic and therapeutic interventions against RVF virus infection. Therefore, this study dealt with the generation and characterization of novel antibodies against RVF and their therapeutic assessment. In a first study (manuscript I) we were able to establish a modified protocol for the generation of single domain antibodies (sdAb) against RVFV by immunization of an alpaca (Vicugna pacos) to produce heavy chain antibodies (HCAb) lacking the corresponding light chain. The RVFV immunized alpaca displayed a high neutralizing antibody titer, which enabled the amplification of variable heavy chain domains (VHH) of HCAbs from the RNA of stimulated peripheral blood mononuclear cells. VHH sequences were ligated into the phagemid vector and a phage library was generated. After three consecutive rounds of panning, RVFV specific antibodies were selected by screening via an immunofluorescence assay (IIFA). The clone harbored a typical VHH sequence and exhibited a significant reactivity against the nucleoprotein (Np) in Western blot and a high affinity in the nM range to RVFV strains from three different phylogenetic lineages. Therefore, the sdAb can be used as a new diagnostic tool for the detection, processing and visualization of Np protein. Additionally, possible therapeutic treatments will be examined in further studies. Manuscript II therefore describes an efficacy study on two monoclonal antibodies (mAb Gn3 and Gn32) raised against recombinant Gn protein for their in vitro and in vivo efficacy against RVFV. Gn3 displayed neutralizing activity in a cell culture model, Gn 32 was inactive. However, co-incubation of Gn32 and Gn3 led to a significantly higher neutralization compared to Gn3 alone, demonstrating cooperative effects. Subsequently, RVFV infected mice were treated with Gn3 alone or in combination with Gn32 by either a post-exposure or a pre-exposure prophylaxis application. Application of Gn3 alone and the combination led to higher survival rate compared to the untreated control group. Subsequent studies in PCR, virus titration and immunohistochemistry showed a reduction of viral loads in all tissues that was significant in the combination groups. One application – post-exposure of combined Gn3 and Gn32 – fully protected mice what was shown by a 100 % survival rate. Thus, we successfully demonstrated for the first time that mouse-derived mAbs in a combined antibody regimen can be a promising approach for an antiviral therapy. In a third study (manuscript III), novel monoclonal antibodies were obtained by immunizing mice with either the vaccine strain MP-12 or the virulent RVFV strain 35 / 74. Both strains induced high neutralizing antibody titers in mice. Mice were therefore used for the generation of mAb secreting hybridoma cells and 14 new mAbs with high affinity to the virus in infected cells measured in an IIFA were obtained. Out of those 14 mAbs only one mAb showed ELISA reactivity against recombinant Np indicating that all others targeted conformational or discontinuous epitopes. Only one single clone displayed a low neutralizing activity in serum neutralization test, which makes this mAb an additional therapeutic candidate.

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Gutjahr, Benjamin: Generation and characterization of antibodies against Rift Valley fever phlebovirus and evaluation of their therapeutic efficacy in a mouse model. Hannover 2019. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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