Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Exploring natural products to boost the host innate immune system against bacterial infections

Yaseen, Ragheda

Staphylococcus (S.) aureus ist weitverbreiteter Verursacher bakterieller Infektionen und einer der weltweit bedeutendsten human-pathogenen Erreger, der lebensbedrohliche Erkrankungen wie Sepsis, Endokarditis oder das Toxic-shock Syndrom auslösen kann. Die komplexen Interaktionen von Wirt und Pathogen sind bis heute nicht vollständig verstanden. Allerdings werden Infektionen mit S. aureus aufgrund der immer häufiger auftretenden Antibiotika-Resistenzen immer schlechter therapierbar und damit weltweit zu einem zunehmenden Problem. Die Natur bietet eine Vielzahl von Kräutern, die traditionell gegen bakterielle Infektionen verwendet wurden. Interessanterweise gibt es natürliche Substanzen, die die Immunreaktion gegen S. aureus stimulieren und verstärken können und damit eine erfolgreiche Abwehr unterstützen. Phagozyten wie die Neutrophilen Granulozyten nehmen in der natürlichen Immunabwehr eine Schlüsselrolle ein und sind auch bei der natürlichen Abwehrreaktion gegen S. aureus von hoher Relevanz. Diese Zellen der angeborenen Immunabwehr bekämpfen Erreger zum Beispiel durch intrazelluläre Phagozytose oder durch extrazelluläre antimikrobielle Wirkmechanismen wie die Bildung von „neutrophil extracellular traps" (NETs). Das Ziel dieser Studie ist es, die Wirkung von ausgewählten Pflanzenextrakten auf die antimikrobielle Aktivität von Neutrophilen gegen S. aureus zu charakterisieren. Das erste Ziel (Kapitel 2) bestand darin, eine Neutrophilen-Zelllinie Human leukemia cell line (HL-60) zu charakterisieren, um die antimikrobielle Wirkung von Neutrophilen gegen S. aureus zu untersuchen. In den meisten Studien werden primäre Neutrophile, frisch isoliert aus Spenderblut, verwendet. HL-60-Zellen werden als alternatives Zellkulturmodell zur Untersuchung der Neutrophilenreaktion auf Infektionen angesehen. Diese Zellen können mittels Dimethyl-Sulfoxid (DMSO) oder oder Behandlung mit Retinsäure differenziert wereden. Das Ziel dieses Kapitels war die Charakterisierung der antimikrobiellen Aktivität von DMSO- und Retinsäure- differenzierten HL-60-Zellen gegen S. aureus im Vergleich zu primären Neutrophilen unter besonderer Berücksichtigung der Bildung von NETs. Die Ergebnisse zeigten, dass sich HL-60-Zellen anders als primäre humane Neutrophile verhalten: HL-60- Zellen zeigen eine verringerte bakterielle Abtötung und signifikant weniger NET- Bildung im Vergleich zu primären Neutrophilen. Daher wurden für die weiterführenden Studien zur Untersuchung der Wirkung von Pflanzenextraktes auf das Immunsystem nur noch primäre humane Neutrophile verwendet. Unter Verwendung von primären Neutrophilen ließ sich zeigen (Kapitel 3), dass Acetonrindenextrakt von Guarthea kunthiana (GUKUBA) die Wirtsabwehr von humanen und bovinen Neutrophilen gegen S. aureus verstärken kann, indem die Bildung von NETs verstärkt wird. Als Folgestudie (Kapitel 4) wurden anschließend neue natürliche Pflanzenextrakte hinsichtlich ihrer pharmakologischen Wirkung auf die angeborene Immunabwehr getestet. Darüber hinaus wurde ihr Potenzial zur Stärkung des Immunsystems des Wirts in Gegenwart von S. aureus untersucht. Dreiundzwanzig ausgewählte Pflanzenextrakte wurden nun auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die antimikrobielle Aktivität von Blutzellen zu verstärken. Drei Pflanzenextrakte konnten die antimikrobielle Aktivität von menschlichem Blut gegenS. aureus signifikant steigern: Rohaceton-Extrakt aus Rinde von Byrsonima crassifolia acetone bark extract (BYCRBA), Verbesina oerstediana Azetonrindenextrakt (VEOEBA) und Madevilla veraguasensis Acetonrebenextrakt (MAVEVA). Alle Extrakte zeigten keine direkte antimikrobielle Wirkung gegen S. aureus. Interessanterweise sind BYCRBA, VEOEBA und MAVEVA aber dazu in der Lage sind, die antimikrobiellen Aktivitäten von menschlichem Blut zu verstärken. In einem nächsten Schritt (Kapitel 5) wurden der Effekt und die biochemischen Mechanismen von BYCRBA auf die antimikrobielle Aktivität von Neutrophilen näher untersucht. Interessanterweise hatte BYCRBA keine Wirkung auf die Phagozytose oder den oxidativen Burst, allerdings verstärkt BYCRBA die Bildung von NETs. Vitexin, das kürzlich als Flavonoid-Komponente dieses BYCRBA-Extrakts identifiziert wurde, zeigte ähnliche Ergebnisse. Weitere Experimente konzentrierten sich auf die zugrundeliegenden biochemischen Mechanismen, die mit diesem Phänomen verbunden sind. Wir fanden heraus, dass BYCRBA und Vitexin den Cholesterinspiegel der Zelle reduzieren, was zu wesentlichen Veränderungen der zellulären Antwort auf die Infektion führen kann. Zusammenfassend stützen die Ergebnisse die Hypothese, dass die Stimulierung des Immunsystems die Effizienz der Wirtsabwehr gegen eindringende Pathogene wie S.aureus verbessern könnte und die konventionelle Antibiotikabehandlung unterstützen oder eine neue Strategie gegen antibiotikaresistente Bakterien bieten könnte.

Staphylococcus (S.) aureus is one of the common etiological agents of bacterial infections. The pathogen represents one of the severe human pathogen that causes life- threatening septicaemia, endocarditis, and toxic shock syndrome. The infection with S. aureus became more risky and a global threatening problem due to the emergence of multiple antibiotic resistances. The complex host-pathogen interaction during infection is still not completely understood. Phagocytes such as neutrophils are the first line in killing of pathogens through phagocytosis or extracellular antimicrobial traps (NETs). However, in case of disease susceptibility, this mechanism is still not strong enough to deal with potent pathogens such as S. aureus. Interestingly, it has been shown that some natural reagents can enhance and boost the immune reaction against S. aureus. The nature provides a lot of herbs that have been traditionally used against bacterial infections. The goal of this study is to characterize the effect of plant extracts on antimicrobial activity of neutrophils against S. aureus infections. The first goal (chapter 2) was to characterize a neutrophil cell line from human leukemia (HL-60 cells) for its usage as a cellular model to investigate the antimicrobial activity of neutrophils against S. aureus. These cells can be differentiated to neutrophils by dimethyl sulfoxide (DMSO) or retinoic acid treatment. The study compared HL60 cell with primary human blood-derived neutrophils, with special emphasis on the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). In 2004, NETs have been discovered as a novel phagocytosis-independent antimicrobial activity of neutrophils. Those traps consist of nuclear DNA and are released by the cells into the extracellular milieu to entrap and kill bacteria. Importantly, the results showed that HL-60 cells behave differently compared to primary human neutrophils, for example HL-60 cells showed reduced bacterial killing and significantly less formation of NETs compared to primary human neutrophils. Thus, we used primary human neutrophils for further studies to detect the effect of plant extract on the immune system. Using primary blood-derived neutrophils, we show in (chapter 3) that acetone bark extract from Guarthea kunthiana (GUKUBA) has the ability to boost the host defense of human and bovine neutrophils against S. aureus by boosting formation of neutrophil extracellular traps. As a follow-up study (chapter 4), novel natural plant extracts from Monteverde Cloud Forest Reserve, Costa Rica provided by Prof. Dr. Setzer were tested for their pharmacological effect on the innate immune capacity. In addition, its potential for boosting the host immune system in presence of human pathogen Staphylococcus aureus has been tested. Twenty three plant extracts were screened for their ability to boost the antimicrobial activity of blood cells. Three plant extracts were able to significantly boost the antimicrobial activity of human blood against S. aureus at a concentration of 10 µg/ml crude acetone extract of bark from Byrsonima crassifolia (BYCRBA), Verbesina oerstediana acetone bark extract (VEOEBA), and Madevilla veraguasensis acetone vine extract (MAVEVA). The growth of S. aureus was monitored and revealed that BYCRBA, VEOEBA and MAVEVA extracts exhibited no direct antimicrobial effect against the bacteria. However, interestingly, we found that BYCRBA, VEOEBA, and MAVEVA are able to boost the antimicrobial activities of human blood. As a next step (chapter 5), the effect and biochemical mechanisms of BYCRBA on the antimicrobial activity of neutrophils was investigated more in detail. Interestingly, BYCRBA had no effect on phagocytosis or oxidative burst, but BYCRBA boost formation of neutrophil extracellular traps. Vitexin, which was recently identified as a flavonoide-component of this BYCRBA extract showed similar results. Further experiments focussed on the underlying biochemical mechanisms associated with this phenomenon. We found out, that BYCRBA and vitexin reduce the cholesterol level of the cell, which may lead to substantial changes in the cellular response to infection. This might explain the increased formation of NETs. This study confirms the presence of bioactive compounds and evaluates the immunomodulatory effect of these plants for potential future therapeutic usage. In summary, the results support the hypothesis that stimulating the immune system might improve the host defence efficiency against invading pathogens such as S. aureus and may support the conventional antibiotic-based treatment or offer a new strategy against antibiotic-resistant bacteria. Development of drugs to boost host innate immunity may help us get around the problem of antibiotic resistance.

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Yaseen, Ragheda: Exploring natural products to boost the host innate immune system against bacterial infections. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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