Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Charakterisierung der genotoxischen, mutagenen und zelltransformierenden Wirkung von nitrosyliertem Häm (NO-Häm) in unterschiedlichen In-vitro-Testsystemen

Kostka, Tina

Laut der IARC gilt der Verzehr von verarbeitetem Fleisch als „kanzerogen für den Menschen“ und der Verzehr von rotem Fleisch als „wahrscheinlich kanzerogen für den Menschen“. Im Vergleich zum nicht als kanzerogen klassifizierten weißen Fleisch ist der Hämgehalt in rotem Fleisch ca. 40-fach höher, wobei diese Hämkomponente durch die Zugabe von Pökelsalzen zusätzlich zu NO-Häm nitrosyliert werden kann. Da NO-Häm die potentiell kanzerogen wirkenden Faktoren „Häm“ und eine „Nitrosogruppe“ vereint, könnte es einen wichtigen Faktor für die kolorektale Kanzerogenese darstellen. Bisher gibt es weder In-vitro- noch In-vivo-Studien zur mutagenen und kanzerogenen Wirkung von NO-Häm, höchstwahrscheinlich aufgrund der schwierigen Synthese und Aufreinigung dieses Stoffes. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, reines NO-Häm herzustellen, gefolgt von der Charakterisierung des genotoxischen, mutagenen und zelltransformierenden Potenzials in unterschiedlichen In-vitro-Testsystemen. NO-Häm wurde dabei nach einem bereits publizierten Protokoll durch die Nitrosylierung von Hemin synthetisiert und anschließend aufgereinigt. Zur Bestimmung der Aufreinigungseffizienz diente die photometrische Bestimmung der Nitritkonzentration in NO-Häm-Lösungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Syntheseverfahrens. Die genotoxischen und mutagenen Effekte von NO-Häm wurden mittels Comet-Assay, sowie des Ames- und HPRT-Tests erfasst. Für Hinweise zu einer möglichen zelltransformierenden Wirkung von NO-Häm diente der BALB/c 3T3-Zelltransformationstest. In der vorliegenden Studie konnte NO-Häm hergestellt und die Nitritkonzentration unterhalb der Quantifizierungsgrenze von 100 µM reduziert werden. NO-Häm führt zu DNA-Strangbrüchen und einer erhöhten Mutationsrate in Säugetierzellen. Obwohl im BALB/c 3T3-Zelltransformationstest keine transformierenden Effekte erfasst wurden, könnte NO-Häm dennoch eine wichtige Rolle bei der mit Fleisch assoziierten Entwicklung von kolorektalen Karzinomen spielen.

In 2015, the IARC classified the consumption of processed meat as “carcinogenic to humans” and red meat as “probably carcinogenic to humans”, while white meat was not classified as carcinogenic at all. Red meat has an up to 40-fold higher heme content when compared to white meat and processed red and white meat contain nitrosylated compounds due to the addition of nitrite during the curing process. Evidence infers that these two factors may be separately involved in the development of colorectal cancer (CRC), even more so when they are combined in a single compound such as nitrosylated heme (NO-heme). Up to now, there are neither in vitro nor in vivo studies specifically investigating the carcinogenic potential of NO-heme, most probably due to its difficult synthesis and purification. Therefore, the aim of the present study was to synthesize pure NO-heme suitable for use in common in vitro systems, followed by the analysis of its potential genotoxic, mutagenic and cell transforming properties. NO-heme was synthesized by nitrosylating hemin using a previously published protocol. Then, the substance was purified and concentrated in order to obtain experimental stock solutions. Purification efficacy was determined using photometric nitrite quantification of NO-heme solutions, while its genotoxic and mutagenic potential was analyzed using the comet assay, the Ames test and the HPRT test. Moreover, the potential of NO-heme to malignantly transform cells was tested in the BALB/c 3T3 cell transformation assay. In the present study, NO-heme was successfully synthesized while the nitrite content was reduced below the detection limit of 100 µM. NO-heme leads to a significant increase of the rate of DNA strand breaks and increases the mutation rate in mammalian cells. However, no effects regarding malignant transformation were detected in the BALB/c 3T3 cell transformation assay. Nevertheless, NO-heme seems to be a possible factor in meat-related CRC development.

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Kostka, T., 2019. Charakterisierung der genotoxischen, mutagenen und zelltransformierenden Wirkung von nitrosyliertem Häm (NO-Häm) in unterschiedlichen In-vitro-Testsystemen. Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover.
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