Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Characterization of calcium regulation in boar spermatozoa and the influence of sperm storage in vitro

Bui, Doanh Huy

Calcium has been identified as a key component in a range of physiological processes in spermatozoa that are essential for fertilization. It serves as a second messenger in the control of sperm (hyperactive) motility, capacitation, and acrosome reaction. Release of calcium from internal stores through ion channels is receptor-mediated. The aim of this study was to examine whether two intracellular calcium release channels, gated by inositol 1,4,5-trisphosphate receptors (IP3R) and ryanodine receptors (RyR), are involved in the regulation of intracellular calcium concentration in boar spermatozoa. Moreover, the impact of hypothermic sperm storage in vitro on the receptor function was examined. Firstly, the protein expression and the localization of IP3R and RyR were investigated. In Western blot analysis, IP3R and RyR were detected with a molecular size larger than 250 kDa. Using indirect immunofluorescence staining, IP3R was detected in the acrosome, post-acrosomal and neck region and the RyR was localized in the acrosome and mid-piece. Secondly, the aim was to determine the potential involvement of IP3R and RyR-gated channels in the regulation of intracellular calcium concentrations. Changes in free intracellular Ca2+ concentration were monitored with Fluo-4 in viable spermatozoa using continuous flow cytometry. Thimerosal, a sensitizer of IP3R and RyR, induced a dose-dependent increase in intracellular Ca2+ levels in a Ca2+-free medium. Blocking of either IP3R with 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) or of RyR with ruthenium red (RR) did not inhibit the thimerosal induced Ca2+ release. Further incubation experiments with 2-APB and RR in the presence of 2 mM Ca2+ in the incubation medium provided indirect evidence that transient receptor potential cation channel subfamily V member (TRPV) are actively involved in the modulation of free intracellular calcium contents of boar spermatozoa. Thirdly, it was investigated whether chilling of boar spermatozoa and long-term storage in the liquid stage affects the response of IP3R and RyR-gated calcium channels to thimerosal. Semen diluted in Beltsville Thawing Solution was stored at 5 °C or 17 °C up to five days and then incubated up to 120 minutes at 38 °C before thimerosal was added. Thermic incubation led to an increase of intracellular calcium in viable, acrosome intact spermatozoa with ongoing storage time in spermatozoa stored at 5 °C. After 60 and 120 minutes thermic incubation of the stored semen samples, the thimerosal response was neither influenced by storage length nor by temperature. In conclusion, IP3R and RyR-gated calcium channels are expressed in boar spermatozoa at the head and proximal region of the flagellum, and they appear to be involved in the regulation of intracellular calcium concentration. There is also indirect evidence for the contribution of TRPV to the regulation of calcium influx from extracellular sources. Chilling and storage of extended boar semen do not affect the functionality of IP3R- and RyR gated calcium channels in viable, acrosome intact spermatozoa after rewarming. Therefore, these intracellular calcium channels need not to be targeted in the development of novel preservation concepts for boar semen.

Calcium ist ein Schlüsselelement für eine Vielzahl physiologischer Funktionen, die essentiell für die Befruchtungsfähigkeit von Spermatozoen sind. Es dient als Second Messenger für die Kontrolle der (hyperaktiven) Spermienmotilität, sowie für die Kapazitation und Akrosomreaktion. Die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern erfolgt rezeptorvermittelt. Das Ziel dieser Studie war es zu untersuchen, ob zwei intrazelluläre Kanäle, die durch Inositol 1,4,5-trisphosphat Rezeptoren (IP3R) und Ryanodine Rezeptoren (RyR) gesteuert werden, an der Regulation der intrazellulären Calciumkonzentration von Eberspermatozoen beteiligt sind. Weiterhin wurde der Einfluss einer hypothermen in vitro-Lagerung von Ebersperma auf die Rezeptorfunktion untersucht. Zunächst wurde die Proteinexpression und die Lokalisation der IP3R und RyR untersucht. Mittels Western Blot wurden beide Rezeptortypen mit einer Molekularmasse größer als 250 kDa detektiert. Die indirekte Immunofluoreszenz ergab für den IP3R eine Anfärbung im akrosomalen und postakrosomalen Bereich sowie in der Spermienhalsregion, während der RyR im Akrosom und im Mittelstück des Spermienschwanzes nachweisbar war. Das zweite Ziel war, die potenzielle Beteiligung der IP3R- und RyR-gesteuerten Kanäle an der Regulation der intrazellulären Calciumkonzentration zu untersuchen. Änderungen der Konzentration an freiem intrazellulären Calcium wurden unter Verwendung von Fluo-4 bei lebenden Spermien mittels kontinuierlicher Durchflusszytometriemessung erhoben. Thimerosal, ein Sensibilisator von IP3R und RyR, induzierte in einem Ca2+-freien Medium einen dosisabhängigen intrazellulären Ca2+–Anstieg. Die Blockierung von IP3R mit 2-Aminoethoxydiphenyl Borat (2-APB) oder von RyR mit Rutheniumrot (RR) führte nicht zu einer Hemmung des thimerosalinduzierten Calciumanstiegs. Weitere Inkubationsexperimente mit 2-APB und RR in Anwesenheit von 2 mM Calcium lieferten einen indirekten Hinweis darauf, dass der Transiente Rezeptor-Potential-Kationenkanal der Unterfamilie V (TRPV) aktiv an der Modulation der freien intrazellulären Calciumkonzentration bei Eberspermatozoen beteiligt ist. Als Drittes wurde untersucht, ob die Abkühlung und Lagerung flüssigkonservierten Eberspermas die Reaktion der IP3R- und RyR-gesteuerten Kanäle auf Thimerosal beeinträchtigt. Sperma wurde in Beltsville Thawing Solution verdünnt und bei 5 °C oder 17 °C bis zu fünf Tagen gelagert. Anschließend wurde es bis zu 120 Minuten bei 38 °C inkubiert und dann Thimerosal zugefügt. Mit zunehmender Lagerungsdauer bei 5 °C führte die thermische Inkubation zu einem Anstieg des intrazellulären Calciumgehaltes in lebenden, akrosomintakten Spermatozoen. Nach 60 und 120 Minuten thermischer Inkubation der gelagerten Spermaproben war weder ein Einfluss der Lagerungsdauer noch der –temperatur auf die Thimersoalreaktion nachweisbar. Schlussfolgernd ist feststellen, dass IP3R- und RyR-gesteuerte Calciumkanäle am Kopf und in der proximalen Region des Flagellums von Eberspermatozoen exprimiert und an der Regulation der intrazellulären Calciumkonzentration beteiligt sind. Weiterhin ergaben sich indirekte Hinweise auf eine Beteiligung von TRPV an der Regulation des Einstroms von Calcium aus extrazellulären Ressourcen. Abkühlung und Lagerung von verdünntem Ebersperma zeigten nach Wiedererwärmung keine Beeinträchtigung der Funktion IP3R- und RyR-gesteuerter Kanäle bei lebenden, akrosomintakten Spermatozoen. Daher ist es nicht notwendig, die Funktionalität dieser intrazellulären Calciumkanäle bei der Entwicklung neuer Konservierungskonzepte für Ebersperma zu berücksichtigen.

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Bui, Doanh: Characterization of calcium regulation in boar spermatozoa and the influence of sperm storage in vitro. Hannover 2019. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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