Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Characterization of Loop Diuretics and Bumetanide Derivatives with Selective Effect on the Neuronal Cation Chloride Cotransporter NKCC1

Hampel, Philip

Epilepsie ist eine der häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen, mit der etwa 50 Millionen Patienten weltweit leben. Von drei Patienten können nur zwei mit den heute zur Verfügung stehenden Therapieoptionen erfolgreich behandelt werden. Ein vergleichbarer medizinischer Notstand besteht bei Neugeborenen, von denen etwa 3 von 1000 nach termingerechter Geburt akute Anfälle entwickeln. In lediglich der Hälfte der Patienten kann Anfallsfreiheit durch eine Behandlung erreicht werden. Eine experimentelle, mechanistisch neue Behandlung für Anfälle, Neugeborenenkrämpfe und Anfälle von chronischen Epilepsiepatienten, wurde in den letzten Jahren untersucht. Diese kombiniert den Inhibitor des neuronalen Na-K-Cl-Cotransporters NKCC1 Bumetanid, ein Schleifendiuretikum, und das GABA-potenzierende Antikonvulsivum Phenobarbital. Bumetanid ist allerdings nicht uneingeschränkt geeignet für die Behandlung von Erkrankungen des Zentralnervensystems, und die Resulate der Kombinationstherapie von präklinischen und klinischen Studien waren widersprüchlich. Eine alternative Substanz, die besser in das Gehirn gelangt und/oder potenter NKCC1 inhibiert, und Bumetanid in der Kombination ersetzt, könnte zu einer verbesserten antikonvulsiven Wirksamkeit der Behandlung führen. Die Potenz zugelassener Schleifendiuretika und des Benzylaminderivates von Bumetanid, Bumepamin, beide NKCC1-Splice-Varianten des Menschen, hNKCC1A und hNKCC1B, zu hemmen, wurde in vitro charakterisiert. In einem Xenopus laevis-Expressionssytem wurde ihr jeweiliger inhibitorischer Effekt auf den NKCC1-vermittelten Transport erfasst. Des Weiteren wurden NKCC1-Effekte von Bumepamin ex vivo elektrophysiologisch untersucht. Die pharmakokinetischen Eigenschaften von Bumepamin wurden in vitro mittels Gewebsbindungsstudien und in vivo mittels Populationskinetiken untersucht. Die antikonvulsive Wirksamkeit von Bumetanid oder Bumepamin allein, oder in Kombination mit Phenobarbital, wurde in zwei Nagermodellen für pharmakoresistente Epilepsie erfasst, dem Kindling-Modell in der Ratte und dem Pilocarpin-induziertem post-Status epilepticus-Modell in der Maus. Azosemid war der potenteste NKCC1-Inhibitor in den Transportversuchen. Darauf folgten in absteigender Potenz Bumetanid, Piretanid, Furosemid und Torasemid, während Ticrynafen und Ethacrynsäure weitaus weniger potente Inhibitoren waren. Die nähere Charakterisierung von Azosemid und Torasemid wird kenntlich machen, ob diese geeignet sind Bumetanid in einer Kombinationstherapie zu ersetzen. Aufgrund der fehlenden Carboxylgruppe dieser Substanzen, in der zum Teil Bumetanids ungünstige pharmakokinetische Eigenschaften begründet liegen, sind beide spannende Kandidaten für diesen Ersatz. Bumepamin war währenddessen in keinem der in vitro-Versuche ein potenter NKCC1-Inhibitor. Gleichzeitig ließen sich höhere Hirnkonzentrationen erzielen, als mit Bumetanid, und es wurde nicht zu dessen Muttersubstanz umgesetzt. Bemerkenswert ist, dass Bumepamin in beiden Epilepsiemodellen zu einer stärkeren Potenzierung des antikonvulsiven Effekts von Phenobarbital führte, als Bumetanid. Bumepamin ist ein sehr spannender Prototyp in der Suche nach einer Substanz, die Bumetanid in der experimentellen Therapie ersetzen kann. Zusammenfassend sind Azosemid, Torasemid und Bumepamin interessante Substanzen, die in der Zukunft zu einer verbesserten Therapiesituation für Patienten mit Anfällen beitragen könnten.

Epilepsy is one of the most common chronic neurologic diseases that affect about 50 million patients worldwide. Only two out of three patients can be treated successfully with the treatment options currently available. A worse treatment gap exists for neonatal patients that develop acute seizures, a condition with an incidence of about 1 per 1 000 newborns. Only half of these patients reach freedom of seizures under treatment. An experimental new treatment option for seizures, both acute neonatal seizures and seizures during chronic epilepsy, that has been investigated in recent years, combines the inhibitor of the neuronal Na-Ka-Cl cotransporter NKCC1 bumetanide, a loop diuretic, and the GABA-potentiating anti-epileptic drug phenobarbital. However, bumetanide has limitations for the treatment of diseases of the central nervous system, and findings in preclinical and clinical studies with the combination treatment were inconsistent. An alternative, which may lead to improved anti-seizure efficacy of the combination treatment, is a more brain permeable and/or more potent NKCC1 inhibitor to substitute bumetanide. The potency of approved loop diuretics and bumepamine, a benzylamine derivative of bumetanide, was characterized in vitro towards both human NKCC1 splice variants, NKCC1A and NKCC1B. In a xenopus laevis expression system their inhibitory effect on NKCC1 transport was evaluated. Furthermore, NKCC1 effects of bumepamine were investigated electrophysiologically ex vivo. The pharmacokinetic properties of bumepamine were examined in vitro using a binding assay and in vivo using population kinetics. The anti-seizure efficacy of either bumetanide or bumepamine alone or in combination with phenobarbital was assessed in two rodent models of pharmacoresistant epilepsy, the rat kindling model and the post-SE pilocarpine model in mice. Azosemide turned out to be the most potent inhibitor of NKCC1 in the transport assays. Azosemide was followed in potency by bumetanide, piretanide, furosemide, and torasemide. Tienilic acid and ethacrynic acid were by far less potent inhibitors. Azosemide and torasemide will need further characterization if they might fit to substitute bumetanide in the combination therapy. Their lack of the carboxyl group that is in part responsible for bumetanide’s disadvantageous pharmacokinetic properties makes them both interesting possibilities. Bumepamine, on the other hand, was found to be no NKCC1 inhibitor in the in vitro settings. However, it reached higher brain concentrations than bumetanide and was not metabolized to its mother substance. Most interestingly, bumepamine was more effective to potentiate phenobarbital’s anti-seizure effect in both rodent models of epilepsy, the rat kindling model and the pilocarpine model. Bumepamine is thus a very noteworthy model substance in the search of a compound to substitute bumetanide in the experimental therapy. To sum it up, azosemide, torasemide, and bumepamine are attractive substances that might lead to the improvement of treatment options for patients with seizures in the future.

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Hampel, Philip: Characterization of Loop Diuretics and Bumetanide Derivatives with Selective Effect on the Neuronal Cation Chloride Cotransporter NKCC1. Gießen 1. Auflage 2019. DVG.

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