Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Effects of substituting sodium chloride and omitting antibiotics in stallion semen diluents for prolonged storage at elevated temperatures

Müller, Yana

In der Pferdezucht werden die meisten Warmblutstuten künstlich besamt. Natives Sperma kann nur für einen begrenzten Zeitraum zur künstlichen Besamung verwendet werden. Die Vitalität der Spermien kann jedoch durch die Verdünnung in spezifischen Medien verlängert werden. Typische Verdünner bestehen aus physiologischen Salzen, Nährstoffen, Pufferlösungen, protektiven Komponenten und Substanzen, die dem mikrobiellen Wachstum entgegenwirken (z.B. Antibiotika und Antimykotika). Die Ziele der in dieser Arbeit beschriebenen Studien waren: (1) Die Untersuchung der Spermienvitalität während der Lagerung in einem an Equiden angepassten Biggers, Whitten und Whittingham Medium (m-eBWWM) mit einer definierten Osmolalität und unterschiedlichen Konzentrationen von NaCl, ChCl, L-Histidin und L-Carnitin, (2) die Bestimmung der Auswirkungen der Zugabe von Magermilchpulver, Coenzym Q10 und Polyvinylalkohol zu m-eBWWM, (3) die Untersuchung der Spermienvitalität während der Lagerung für bis zu 7 Tage bei Temperaturen im Bereich von 5–30°C und (4) die Bestimmung, ob der getestete Verdünner zur Lagerung von Hengstsamen ohne den Zusatz von Antibiotika bei 5°C und 17°C verwendet werden kann. Im ersten Teil dieser Studie wurde die Spermienvitalität während der Lagerung mit Verdünnern, die Modifikationen des m-eBWWM waren, untersucht. Diese m-eBWW Medien wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von NaCl, ChCl (95/0, 47,5/47,5, 0/95 mM) oder L-Histidin und/oder L-Carnitin (200/0, 100/100 mM) hergestellt. Erhöhte intrazelluläre Natriumkonzentrationen führen typischerweise zur Aktivierung von Na+-K+-ATPasen, um die Homöostase aufrechtzuerhalten; dies geschieht unter Verbrauch von ATP. Es konnte gezeigt werden, dass die Spermienvitalität während der gekühlten Lagerung durch die Verwendung eines Mediums erhöht werden kann, in welchem NaCl entweder durch ChCl oder L-Histidin und/oder L-Carnitin ersetzt wurde. Die höchsten Prozentsätze motiler Spermien und Spermien mit intakter Plasmamembran wurden bei der Verwendung von L-Histidin in der Kombination mit L-Carnitin gemessen. Nachdem festgestellt wurde, dass die Spermienvitalität nach einer ersten Verdünnung in einem magermilchhaltigen Verdünner im m-eBWW-Medium mit L-Histidin/L-Carnitin besser aufrecht erhalten werden konnte, wurde der Effekt der Zugabe von Magermilchpulver (SMP) untersucht. Darüber hinaus wurden mögliche positive Effekte der Zugabe von Coenzym Q10 und PVA untersucht. Die Zugabe von 0,5% SMP zum m-eBWW-Medium erhöhte die Spermienvitalität, während die Supplementierung mit Coenzym Q10 und PVA keine signifikanten Auswirkungen auf die Vitalität der Spermien während der Lagerung für bis zu 7 Tage bei 5°C oder 17°C zeigte. Spermien, die bei 5°C gelagert werden, sind einem Kälteschock ausgesetzt, welcher sich in verminderter Beweglichkeit und Membranintegrität zeigt. Um einen Kälteschock zu vermeiden, wurde untersucht, ob Spermien nach der Verdünnung mit m-eBWWM bei höheren Temperaturen gelagert werden können. Die Spermienvitalität wurde daher während der Lagerung für bis zu 7 Tage bei Temperaturen von 5–30°C verfolgt. Bei der Verwendung von m-eBWWM mit L-Histidin, L-Carnitin und SMP schien eine Konservierung und Lagerung der Spermien für 7 Tage bei 5°C sowie eine dreitägige Lagerung bei 17°C möglich. So nahmen die Prozentsätze membranintakter und beweglicher Spermien während der siebentägigen Lagerung zwar ab, was während der Lagerung bei höheren Temperaturen jedoch stärker der Fall war. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss der Antibiotika-supplementierung auf die Spermienvitalität während der Langzeitlagerung bei verschiedenen Temperaturen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das Vorhandensein von Antibiotika im ersten Zentrifugations-Verdünnungsmedium ausreichend ist, um das Bakterienwachstum während der Lagerung in einem antibiotikafreien Verdünner für 7 Tage bei 5°C zu verhindern. Darüber hinaus wurde die Anfälligkeit der Spermien-DNA für eine Denaturierung durch Säure analysiert, die als Maß für die Intaktheit von Chromatin und die Befruchtungsfähigkeit der gelagerten Spermien dient. Der so ermittelte DNA-Fragmentierungsindex zeigte keine drastischen Unterschiede zwischen der Samenverarbeitung und den getesteten Lagerungsbedingungen. Zusammenfassend wird in der aktuellen Studie gezeigt, dass ein m-eBWW-Medium, in dem NaCl durch L-Histidin und L-Carnitin ersetzt wurde, ergänzt mit 0,5% SMP, die Spermienvitalität bei der Lagerung für 7 Tage bei 5°C oder für 3 Tage bei 17°C bewahrt. Darüber hinaus schien das Vorhandensein von Antibiotika in dem für die Erstverdünnung und Zentrifugation verwendeten Verdünner auszureichen, um das Bakterienwachstum während der Lagerung in einem antibiotikafreien Verdünner zu verhindern.

In the horse breeding industry, most of the warmblood mares are inseminated via artificial insemination. Raw semen can be used only for a limited period of time for artificial insemination. Sperm longevity, however, can be prolonged when diluting in specific ‘extenders’. Typical extenders are composed of physiological salts, nutrients, buffering compounds, protective agents, and agents that counteract microbial growth (i.e. antibiotics and antimycotics). The aims of the studies described in this thesis were to: (1) investigate sperm viability during storage in a medium of a defined osmolality with varying NaCl, ChCl, L-histidine and L-carnitine concentrations, (2) determine effects of adding skim milk powder, coenzyme Q10 and polyvinyl alcohol to the storage medium, (3) investigate stallion sperm viability during storage for up to 7 d at temperatures ranging from 5−30°C, and (4) determine if diluents without antibiotics can be used for storing stallion semen at 5 and 17°C. In the first part of this study, sperm viability was investigated during storage using diluents that were modifications of Biggers, Whitten and Whittingham Medium, originally described elsewhere. Modified equine BWW media (m-eBWWM) were prepared with varying NaCl and ChCl concentrations (95/0, 47.5/47.5, 0/95 mM) as well as NaCl replacement by L-histidine and/or L-carnitine (200/0, 100/100 mM) concentrations. Increased intracellular sodium concentrations typically result in the activation of Na+-K+-ATPases to maintenance homeostasis under ATP consumption. It could be shown that sperm viability during cooled storage could be increased by using a medium in which NaCl was replaced with ChCl or L-histidine and/or L-carnitine. Highest percentages of membrane intact and motile sperm were found using L-histidine and L-carnitine. After finding that m-eBWW medium in which NaCl was replaced by L-histidine and L-carnitine preserves sperm viability only after initial dilution in milk-containing extender, the effect of adding skim milk powder (SMP) was investigated. In addition, possible beneficial effects of also adding coenzyme Q10 and PVA were evaluated. We found that adding 0.5% SMP to m-eBWWM increased sperm viability whereas supplementation with coenzyme Q10 and PVA showed no significant effects on sperm viability during 7 d storage at 5°C or 17°C. Sperm stored at 5°C are exposed to cold-shock, which is evident as decreased motility and membrane intactness. In order to prevent cold shock, it was investigated if sperm could be stored at higher temperatures when using m-eBWW. Sperm viability was therefore followed during storage for up to 7 d at temperatures ranging from 5−30°C. If using m-eBWWM containing histidine/carnitine and SMP, as a diluent, sperm preservation and storage for 7 d at 5°C seemed feasible, as well as 3 d storage at 17°C. Anyways, during storage percentages of membrane intact and motile sperm decreased, which occurred to a greater extent when stored at higher temperatures. In the last part of this study, the impact of antibiotics supplementation on sperm viability during long-term storage at various temperatures was evaluated. It could be shown that the presence of antibiotics in the first diluent is sufficient to prevent bacterial growth during storage in antibiotics-free diluent for 7 d at 5°C. Furthermore, as a measure for chromatin intactness and fertility, the susceptibility of sperm DNA to acid denaturation was analyzed. Derived DNA fragmentation index values showed no drastic differences amongst the semen processing nor storage conditions tested. Taken together, in the current study it is shown that a m-eBWW medium in which NaCl is substituted with L-histidine and L-carnitine, supplemented with 0.5% SMP preserves sperm viability during 7 d storage at 5°C or 3 d storage at 17°C. Furthermore, presence of antibiotics in the diluent used for initial dilution and centrifugation appeared sufficient for preventing bacterial growth during storage in antibiotics-free diluent.

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Müller, Yana: Effects of substituting sodium chloride and omitting antibiotics in stallion semen diluents for prolonged storage at elevated temperatures. Hannover 2019. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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