„Entwicklung, Validierung und Anwendung eines isothermalen Amplifikationssystems (LAMP) für die Detektion von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in kleinen Wiederkäuern und Genotypisierung mit MIRU-VNTR"

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Johne´schen Krankheit (JD) und ist eine chronische, granulomatöse schwere Form der Enteritis mit fortschreitendem Gewichtsverlust und Abmagerung bei Wiederkäuern, welche letztendlich zum Tode führt. Infizierte Tiere verbreiten MAP über Kot und Milch und dieses resultiert in einer Verteilung in der Umwelt und in einen Eintrag in die Lebensmittelkette. In der Umwelt und in Lebensmitteln kann MAP über einen längeren Zeitraum überleben und behält dabei seine Pathogenität und kann somit andere Tiere, auch nicht-wiederkäuende Arten, sowie Menschen infizieren. Ob eine MAP-Infektion im Zusammenhang mit Morbus Crohn steht, wird noch immer diskutiert. Jedoch war es möglich, MAP aus menschlichem Stuhl zu isolieren, obwohl keine Morbus Crohn Erkrankung vorlag. Somit ist es bestätigt, dass auch Menschen Träger für MAP sein können. Um frühestmöglich infizierte Tiere zu entdecken, die noch keine klinischen Symptome der Johne´schen Krankheit zeigen, aber bereits Ausscheider sind, wurde in dieser Arbeit die LAMP-Methode (loop-mediated isothermal amplification), die hoch sensitiv, zeitsparend und anwenderfreundlich ist, entwickelt. Bei der LAMP-Methode wird eine strangversetzende DNA-Polymerase verwendet, deren Reaktion bei einer konstanten Temperatur (isothermal) abläuft. LAMP zeichnet sich dadurch aus, dass vier bis sechs Primer an sechs bis acht DNA-Sequenzen binden und somit diese Methode eine höhere Spezifität besitzt als herkömmliche PCR´s. Dabei wurde für den Nachweis von MAP in Milch und Kot kleiner Wiederkäuer ein Primerset entwickelt, welches für das Insertionselement ISMap02 spezifisch ist. Die Nachweisgrenze von LAMP lag bei 3,8 MAP KBE/ ml Milch und 12,5 MAP KBE/g Kot, welche im Vergleich zu anderen Detektionsmethoden, wie zum Beispiel herkömmlichen PCR´s, die auf andere Insertionselemente abzielen, eine sehr hohe analytische Sensitivität bietet. Dieses System ermöglichte es, bereits kleine Mengen MAP im Kot der Tiere nachzuweisen, obwohl sie noch keine Symptome zeigten. Dieses Verfahren stellt eine wichtige Methode zur Eindämmung der MAP-Ausbreitung dar. Neben der MAP-Detektion in dieser Arbeit wurden auch unterschiedliche MAP-Isolate von verschiedenen Spezies mittels Genotypisierung (mycobacterial interspersed repetitive units- variable number tandem repeats MIRU-VNTR) untersucht. Diese MIRU-VNTR sind spezifisch für Mykobakterien und finden in der Genotypisierung von Isolaten eine Anwendung unter Umständen zur Feststellung des Infektionsursprungs. MIRU-VNTR zeichnen sich zudem dadurch aus, dass es sich um DNA-Stellen handelt, die im Genom von Mykobakterien verteilt sind, wobei an jeder Stelle eine bestimmte Nukleotidsequenz in mehr als einer Kopie vorhanden ist. In dieser Arbeit war es möglich zu zeigen, dass sowohl kleine Wiederkäuer als auch Menschen gleiche MIRU-VNTR-Muster aufzeigen. Dafür wurden MAP-Isolate von kleinen Wiederkäuern und Menschen verglichen und einer Genotypisierung unter Verwendung von acht verschiedenen MIRU-VNTR-Loci unterzogen. Zwei verschiedene Genotypen von humanen MAP-Isolaten wurden basierend auf dem Größenpolymorphismus erkannt, der an einem Lokus (VNTR 7) beobachtet und durch Sequenzierung bestätigt wurde. Gemäß der INMV-Nomenklatur (French National Institute for Agricultural Research Nouzilly MIRU-VNTR), die auf der numerischen Abfolge der Wiederholungen auf acht verschiedenen MIRU-VNTR-Loci basiert, gehörten die in dieser Studie verwendeten MAP-Isolate von Schafen zu zwei Genotypen (INMV 9 und INMV 217). Die MAP-Isolate von Ziegen konnten auch zwei Genotypen zugeordnet werden (INMV 2 und INMV 142). Da bisher keine Wiederholungsmuster für MAP-Isolate von Menschen in Deutschland beschrieben wurden, wurden die numerischen Codes für diese bereitgestellt und von der MAC-INMV-SSR-Datenbank zwei neue INMV-Codes für diese Isolate zugewiesen (INMV 240 und 241). Diese Studie liefert wichtige Informationen zu gemeinsamen identischen MIRU-VNTR-Genotypen von kleinen Wiederkäuern, Rindern und Menschen, was darauf hindeutet, dass eine Übertragung zwischen den verschiedenen Wirten stattgefunden hat.