Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

„Entwicklung, Validierung und Anwendung eines isothermalen Amplifikationssystems (LAMP) für die Detektion von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in kleinen Wiederkäuern und Genotypisierung mit MIRU-VNTR"

Sange, Marie Daniéle

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Johne´schen Krankheit (JD) und ist eine chronische, granulomatöse schwere Form der Enteritis mit fortschreitendem Gewichtsverlust und Abmagerung bei Wiederkäuern, welche letztendlich zum Tode führt. Infizierte Tiere verbreiten MAP über Kot und Milch und dieses resultiert in einer Verteilung in der Umwelt und in einen Eintrag in die Lebensmittelkette. In der Umwelt und in Lebensmitteln kann MAP über einen längeren Zeitraum überleben und behält dabei seine Pathogenität und kann somit andere Tiere, auch nicht-wiederkäuende Arten, sowie Menschen infizieren. Ob eine MAP-Infektion im Zusammenhang mit Morbus Crohn steht, wird noch immer diskutiert. Jedoch war es möglich, MAP aus menschlichem Stuhl zu isolieren, obwohl keine Morbus Crohn Erkrankung vorlag. Somit ist es bestätigt, dass auch Menschen Träger für MAP sein können. Um frühestmöglich infizierte Tiere zu entdecken, die noch keine klinischen Symptome der Johne´schen Krankheit zeigen, aber bereits Ausscheider sind, wurde in dieser Arbeit die LAMP-Methode (loop-mediated isothermal amplification), die hoch sensitiv, zeitsparend und anwenderfreundlich ist, entwickelt. Bei der LAMP-Methode wird eine strangversetzende DNA-Polymerase verwendet, deren Reaktion bei einer konstanten Temperatur (isothermal) abläuft. LAMP zeichnet sich dadurch aus, dass vier bis sechs Primer an sechs bis acht DNA-Sequenzen binden und somit diese Methode eine höhere Spezifität besitzt als herkömmliche PCR´s. Dabei wurde für den Nachweis von MAP in Milch und Kot kleiner Wiederkäuer ein Primerset entwickelt, welches für das Insertionselement ISMap02 spezifisch ist. Die Nachweisgrenze von LAMP lag bei 3,8 MAP KBE/ ml Milch und 12,5 MAP KBE/g Kot, welche im Vergleich zu anderen Detektionsmethoden, wie zum Beispiel herkömmlichen PCR´s, die auf andere Insertionselemente abzielen, eine sehr hohe analytische Sensitivität bietet. Dieses System ermöglichte es, bereits kleine Mengen MAP im Kot der Tiere nachzuweisen, obwohl sie noch keine Symptome zeigten. Dieses Verfahren stellt eine wichtige Methode zur Eindämmung der MAP-Ausbreitung dar. Neben der MAP-Detektion in dieser Arbeit wurden auch unterschiedliche MAP-Isolate von verschiedenen Spezies mittels Genotypisierung (mycobacterial interspersed repetitive units- variable number tandem repeats MIRU-VNTR) untersucht. Diese MIRU-VNTR sind spezifisch für Mykobakterien und finden in der Genotypisierung von Isolaten eine Anwendung unter Umständen zur Feststellung des Infektionsursprungs. MIRU-VNTR zeichnen sich zudem dadurch aus, dass es sich um DNA-Stellen handelt, die im Genom von Mykobakterien verteilt sind, wobei an jeder Stelle eine bestimmte Nukleotidsequenz in mehr als einer Kopie vorhanden ist. In dieser Arbeit war es möglich zu zeigen, dass sowohl kleine Wiederkäuer als auch Menschen gleiche MIRU-VNTR-Muster aufzeigen. Dafür wurden MAP-Isolate von kleinen Wiederkäuern und Menschen verglichen und einer Genotypisierung unter Verwendung von acht verschiedenen MIRU-VNTR-Loci unterzogen. Zwei verschiedene Genotypen von humanen MAP-Isolaten wurden basierend auf dem Größenpolymorphismus erkannt, der an einem Lokus (VNTR 7) beobachtet und durch Sequenzierung bestätigt wurde. Gemäß der INMV-Nomenklatur (French National Institute for Agricultural Research Nouzilly MIRU-VNTR), die auf der numerischen Abfolge der Wiederholungen auf acht verschiedenen MIRU-VNTR-Loci basiert, gehörten die in dieser Studie verwendeten MAP-Isolate von Schafen zu zwei Genotypen (INMV 9 und INMV 217). Die MAP-Isolate von Ziegen konnten auch zwei Genotypen zugeordnet werden (INMV 2 und INMV 142). Da bisher keine Wiederholungsmuster für MAP-Isolate von Menschen in Deutschland beschrieben wurden, wurden die numerischen Codes für diese bereitgestellt und von der MAC-INMV-SSR-Datenbank zwei neue INMV-Codes für diese Isolate zugewiesen (INMV 240 und 241). Diese Studie liefert wichtige Informationen zu gemeinsamen identischen MIRU-VNTR-Genotypen von kleinen Wiederkäuern, Rindern und Menschen, was darauf hindeutet, dass eine Übertragung zwischen den verschiedenen Wirten stattgefunden hat.

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) is the causative agent of Johne's Disease (JD) and is a chronic, granulomatous severe form of enteritis with progressive weight loss and emaciation in ruminants, which ultimately leads to death. Infected animals spread MAP via feces and milk, and this results in a distribution in the environment and an entry into the food chain. MAP can stay pathogenic in the environment and milk products and therefore infect other animals, including non-ruminant species, as well as humans. Whether MAP infection is related to Crohn's disease is still being discussed. However, it was possible to isolate MAP from human stool, although Crohn's disease was not present. Thus, it is confirmed that humans can also be carriers of MAP. In order to discover the earliest possible infected animals that do not yet show clinical signs of Johne's disease but are already excretors, the LAMP method (loop-mediated isothermal amplification), which is highly analytically sensitive, time-saving and user-friendly, was developed in this work. The LAMP method uses a strand-displacing DNA polymerase whose reaction proceeds at a constant temperature (isothermal). LAMP is characterized by the fact that four to six primers bind to six to eight DNA sequences and thus this method has a higher specificity than conventional PCR's. For the detection of MAP in milk and feces of small ruminants, a primer set was developed which is specific for the insertion element ISMap02. The detection limit of LAMP was 3.8 MAP CFU / ml milk and 12.5 MAP CFU / g feces, which are very high in analytical sensitivity and compared to other detection methods, such as conventional PCR´s targeting other insertion elements. This system made it possible to detect small amounts of MAP in feces even though the animals did not show any symptoms. The LAMP- assay is an important method for controlling MAP spread. Not only MAP detection in this work has been investigated, but also genotyping of various MAP isolates has been performed using the mycobacterial interspersed repetitive units-variable number tandem repeats (MIRU-VNTR). These MIRU-VNTR are specific for mycobacteria and find an application in the genotyping of isolates to determine the source of infection. MIRU-VNTR are also characterized by being DNA sites distributed in the genome of mycobacteria, with a distinct nucleotide sequence present in more than one copy at each site. These are arranged side by side. In this work it was possible to show that both small ruminants and humans show the same MIRU-VNTR patterns. Therefore, MAP isolates from small ruminants and humans were compared and subjected to genotyping using eight different MIRU-VNTR loci. Two different genotypes of human MAP isolates were identified based on the size polymorphism observed at one site (VNTR 7) and confirmed by sequencing. According to the INMV nomenclature based on the numerical sequence of repetitions on eight different MIRU-VNTR loci, the sheep MAP isolates used in this study belonged to two genotypes (Nouzilly MIRU-VNTR), INMV 9 and INMV 217. Goat MAP isolates could also be assigned to two genotypes (INMV 2 and INMV 142). Since MIRU-VNTR patterns of MAP isolates from humans have not yet been reported in Germany, the numerical codes have been provided for them and two new INMV codes were assigned by the MAC-INMV-SSR database for these isolates (INMV 240 and 241). This study provides important information on common identical MIRU-VNTR genotypes of small ruminants, cattle and humans, suggesting that transfer between the different hosts can occur.

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Sange, Marie: „Entwicklung, Validierung und Anwendung eines isothermalen Amplifikationssystems (LAMP) für die Detektion von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in kleinen Wiederkäuern und Genotypisierung mit MIRU-VNTR". Hannover 2019. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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