Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Vergleichende Untersuchungen zur Effizienz der Antikörperbildung und Antikörperfunktion nach Mehrfachimmunisierung von Schweinen gegen Mycoplasma hyopneumoniae

Kloker, Anja

Mycoplasma (M.) hyopneumoniae ist der Erreger der enzootischen Pneumonie, einer chronischen Atemwegsinfektion des Schweines, durch die weltweit große wirtschaftliche Verluste in der Schweineproduktion verursacht werden. Charakteristisch für die enzootische Pneumonie ist ein trockener Husten, und die Erkrankung verläuft mit hoher Morbidität und geringer Mortalität. Obwohl die Impfung die am häufigsten angewendete Kontrollmaßnahme darstellt, verleiht sie nur partiellen Schutz und die Effektivität der Immunisierung ist nicht immer befriedigend. Da keine Unterscheidung zwischen maternalen, Impf- und Infektionsantikörpern möglich ist, wird es erschwert, die Ursachen für das Ausbleiben eines adäquaten Impferfolges zu klären. Um genaue Informationen darüber zu erhalten, in welchem Ausmaß und welche Antikörper bei einer Impfung nach Ausschalten möglicher beeinflussender Umweltfaktoren gebildet werden, war der Gegenstand dieser Arbeit die Gewinnung und Charakterisierung von Hyperimmunseren vom Schwein gegenüber den häufig verwendeten Impfantigenen Stamm J, Stamm 11 und Stamm P-5722-3 (NL 1042). Durch die Untersuchung des Einflusses der im Rahmen der Hyperimmunisierung gebildeten Antikörper in Serum und BALF auf das in-vitro-Wachstum von M. hyopneumoniae wurde eine Einschätzung der Effizienz der verschiedenen Impfstoffe vorgenommen. Ein weiteres wesentliches Ziel der Arbeit war die Etablierung und Erprobung von qPCR-Assays zum Nachweis spezifischer DNA Sequenzen von M. hyopneumoniae, M. hyorhinis und M. flocculare, um einerseits das Vorliegen einer Infektion bei der Gewinnung der Hyperimmunseren ausschließen zu können, und um andererseits beim Nachweis spezifischer Antikörper falsche Interpretationen der Untersuchungsergebnisse auf Grund von Kreuzreaktionen zu vermeiden. Für die qPCR zum Nachweis von M. hyopneumoniae konnte ein Detektionslimit von 22, für M. hyorhinis von 28 und für M. flocculare von 25 Genomkopien ermittelt werden. Bei zwei Versuchstieren konnte M. flocculare nachgewiesen werden. Es wurden 37 Lungenproben mit Läsionen auf das Vorhandensein spezies-spezifischer DNA untersucht. In zehn (27,0%) Proben konnte M.-hyopneumoniae- und in jeweils acht (21,6%) M. hyorhinis- und M. flocculare-spezifische DNA nachgewiesen werden. Für die Herstellung der Hyperimmunseren gegen M. hyopneumoniae wurden vier kommerziell erhältliche Präparate (Stellamune® Mycoplasma, Firma Elanco; Suvaxyn® M. Hyo, Firma Zoetis; Porcilis® PCV M. Hyo und Porcilis® M. Hyo, Firma MSD) ausgewählt. Mit diesen Impfstoffen wurden jeweils zwei acht Wochen alte, M. hyopneumoniae freie und nicht geimpfte Tiere immunisiert. Im Abstand von einer oder zwei Wochen wurden vier Wiederholungsimpfungen durchgeführt. Das Vorhandensein spezifischer Antikörper in den Seren und der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) wurde mittels Western Immunoblot überprüft. Für die Quantifizierung von spezifischen IgG in den Seren wurde ein ELISA (IDEXX M. hyo Ab Test, IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine) verwendet. Es wurde zudem der Einfluss der Hyperimmunseren und BALF auf das in vitro Wachstum von M. hyopneumoniae in ML Medium (Mycoplasma Liquid Medium, Mycoplasma Experience Ltd, Bletchingley, England) untersucht. Im Western Immunoblot wurde eine Vielzahl an spezifischen Reaktionen der Antikörper aus den Seren und BALF Proben mit M. hyopneumoniae Stamm 232 Ganzzelllysat nachgewiesen. Die im ELISA ermittelten P/PK Werte in den Seren bei Versuchsende reichen von 1,58 bis 1,86 und befinden sich deutlich im positiven Bereich. Das kulturelle Wachstum von M. hyopneumoniae in ML Medium wurde, gemessen an DNA Zelläquivalenten, durch alle BALF Proben signifikant (p < 0,01) gehemmt. Diese Wachstumshemmung war durch Antikörper, die durch die Immunisierung mit Porcilis® PCV M. Hyo induziert wurden, am deutlichsten. Die Seren von drei Tieren, die mit Suvaxyn® M. Hyo oder Stellamune® Mycoplasma geimpft wurden, haben zu einer numerischen Reduktion der Bakterienzahl geführt. Durch die übrigen Seren wurde das Wachstum mit p < 0,05 bzw. p < 0,01 signifikant gehemmt. Unter identischen Versuchsbedingungen werden durch die hier angewendeten Impfstoffe zwar vergleichbare Mengen an spezifischen Antikörpern im Serum induziert, diese unterscheiden sich jedoch signifikant in ihrer Effizienz, das Wachstum von M. hyopneumoniae in vitro zu hemmen. Durch spezifische BALF Antikörper wird das Wachstum von M. hyopneumoniae deutlicher gehemmt als durch Serum Antikörper.

Mycoplasma (M.) hyopneumoniae is the etiological agent of enzootic pneumonia, a chronic respiratory disease of pigs, which causes major economic losses in the pig industry worldwide. Enzootic pneumonia is characterized by dry and non-productive cough with high morbidity and low mortality. Although vaccination is the most commonly used control measure, it confers only partial protection and prevents neither the transmission of the pathogen nor infection of the pigs. Hence, the effectiveness of immunization is not always satisfactory. Since distinction between antibodies due to infection or due to immunization or maternal antibodies is not possible, it is difficult to clarify the causes of the lack of adequate vaccine success. In order to obtain accurate information on the extent and which antibodies are formed at vaccination after elimination of potential environmental impact factors, one of the aims of this project was to produce and characterize swine hyper-immune sera against M. hyopneumoniae vaccine strains J, 11 and P-5722-3 (NL 1042). The impact of hyper immune sera and BALF on in vitro growth of M. hyopneumoniae was evaluated in this study, to assess the efficacy of the various vaccines. On the one hand, confirming the negative M. hyopneumoniae infection status of the hyper immunized animals is important, and on the other hand, knowing the status of infection with M. hyorhinis or M. flocculare is as well necessary, because there are possible crossreactivities of the antibodies. Therefore, another aim of the project was to establish a quantitative real time PCR (qPCR) assay to distinguish as well as quantify M. hyopneumoniae, M. hyorhinis and M. flocculare from lung tissue. The detection limit of the M. hyopneumoniae, M. hyorhinis and M. flocculare qPCR assays was determined 22, 28 and 25 organisms, respectively. Lung samples from two immunized animals were positive for M. flocculare. In total, 37 lung samples showing typical lesions were examined for species specific DNA. In ten (27.0%) lungs M. hyopneumoniae specific DNA was detected and DNA specific for M. hyorhinis and M. flocculare was present in eight (21.6%) lungs each. Four commercially available vaccines (Stellamune® Mycoplasma, Elanco; Suvaxyn® M. Hyo, Zoetis; Porcilis® PCV M. Hyo and Porcilis® M. Hyo, MSD) were selected for preparation of hyper immune sera against M. hyopneumoniae. These vaccines were given to two eight weeks old M. hyopneumoniae-free and previously unvaccinated animals each. Booster doses were applied four times in one or two weeks interval. The presence of specific antibodies in serum and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was evaluated by using Western immunoblot analysis. Quantification of specific IgG in sera and IgA in BALF was performed with ELISA (IDEXX M. hyo Ab Test, IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine). Furthermore, the impact of hyper immune sera and BALF on in vitro growth of M. hyopneumoniae in ML media (Mycoplasma Liquid Medium, Mycoplasma Experience Ltd, Bletchingley, UK) was tested. Western immunoblot analysis revealed numerous interactions between specific antibodies from serum and BALF and M. hyopneumoniae strain 232 whole cell lysate. ELISA S/P ratios in sera ranged from 1.58 to 1.86 in the final hyper immune serum, depicting clear positive test results. Growth of M. hyopneumoniae cells in ML media was significantly (p < 0.01) inhibited by the addition of BALF samples. Inhibition of growth was most pronounced by antibodies induced by vaccine Porcilis® PCV M. Hyo. Hyper immune sera from three animals, vaccinated with Suvaxyn® M. Hyo or Stellamune® Mycoplasma, led to a decrease in bacterial titer. For the remaining five sera, inhibition of growth was significantly different compared to growth in media without specific antibodies for M. hyopneumoniae (p < 0.05 or p < 0.01). Under identical experimental conditions, the vaccines used here induce comparable levels of specific antibodies in the serum, but these differ significantly in their efficacy to inhibit the growth of M. hyopneumoniae in vitro. Specific BALF antibodies inhibit the growth of M. hyopneumoniae more than serum antibodies.

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Kloker, Anja: Vergleichende Untersuchungen zur Effizienz der Antikörperbildung und Antikörperfunktion nach Mehrfachimmunisierung von Schweinen gegen Mycoplasma hyopneumoniae. Hannover 2019. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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