Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Comparison of various methods for quantification of equine insulin under clinical settings for assessment of insulin dysregulation

Warnken, Tobias

Das Equine Metabolische Syndrome (EMS) ist eine heutzutage zunehmend häufiger auftretende Endokrinopathie und stellt ein erhebliches Gesundheitsrisiko für die Pferdepopulation dar. Aktuelle Untersuchungen zeigen, dass neben der Vielzahl an teilweise charakteristischen klinischen Symptome des EMS, die Insulindysregulation (ID) mit einer einhergehenden Hyperinsulinämie das einzige Symptom ist, das eindeutig mit der Entstehung einer endokrinopathischen Hufrehe in Verbindung zu bringen ist. Eine ID kann sich auf verschiedene Arten manifestieren, wie zum Beispiel als basale Hyperinsulinämie, als übermäßige oder anhaltende hyperinsulinämische Reaktion auf oral aufgenommene oder intravenös verabreichte Kohlenhydrate oder als Insulinresistenz (IR) der peripheren Gewebe. Die Diagnostik einer ID kann unter Verwendung von basalen Blutproben oder auf der Grundlage von verschiedenen dynamischen Stimulationstests durchgeführt werden. Die unterschiedlichen Testverfahren zielen hierbei entweder auf die Identifizierung der ID oder einer IR ab. Gegenwärtig werden orale glykämische Stimulationstests empfohlen um eine ID durch eine unter standardisierten Bedingungen hervorgerufene postprandiale Hyperinsulinämie zu identifizieren. Unabhängig von den verschiedenen physiologischen Abläufen der verschiedenen Testverfahren erfordern die meisten Diagnostikverfahren eine sich anschließende labordiagnostische Analyse der Insulinkonzentrationen in entnommenen Blutproben des untersuchten Patienten. Es zeigte sich bereits in früheren Studien, dass deutliche Unterschiede zwischen den verschiedenen eingesetzten Immunoassay-Methoden in Bezug auf die gemessenen Insulinkonzentrationen bestehen. Der Gegenstand dieses Forschungsprojekts bestand darin, die Quantifizierung von equinem Insulin unter der Berücksichtigung der klinischen Anforderungen und Bedingungen zu untersuchen und die Diagnostik der equinen ID durch eine geeignete Kombination aus einem dynamischen Diagnostiktest und der anschließenden Quantifizierung von equinem Insulin mittels einer geeigneten und zuverlässigen immunoassay-basierten Messmethode zu optimieren. Das erste Ziel dieses Forschungsprojekts war es, drei häufig verwendete Immunoassays im Hinblick auf ihre Eignung zur Analyse von equinem Insulin zu vergleichen. Besonderes Augenmerk wurde hierbei auf die Assay-spezifischen Eigenschaften und deren klinische Anwendbarkeit bei der Beurteilung der ID gelegt. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurden sowohl basale, nüchtern Blutproben, als auch unter Stimulation entnommene Blutproben untersucht. Mittels eines OGT basierend auf der Applikation einer definierten Glukosemenge über eine Nasenschlundsonde konnte ein breites Spektrum an Proben mit unterschiedlichen Insulinkonzentrationen generiert werden. Im Rahmen des ersten Teils des Forschungsprojektes wurden ein für den Einsatz beim Pferd optimierter Enzym-gebundener Immunosorbens-Assay (ELISA) basierend auf spezifischen gegen das porzine Insulin gerichteten Antikörpern, ein Radioimmunoassay (RIA), ebenfalls basierend auf spezifischen Antikörpern gegen das porzine Insulin und ein human-spezifischer Insulin Chemilumineszenz-Immunoassay (CLIA) verglichen. Zusammenfassend zeigten sich große Diskrepanzen in Bezug auf die gemessenen Insulinkonzentrationen zwischen den drei verschiedenen Immunoassays. Die Ergebnisse der Untersuchung zeigen, dass die Berücksichtigung des zur Messung eingesetzten Immunoassays und die Anwendung zuverlässiger Assay-spezifischer Referenzbereiche oder Grenzwerte für die klinische Interpretation und Diagnose einer ID von besonderer Bedeutung und zwingend erforderlich sind. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde das zweite Ziel des Forschungsprojekts formuliert. Ziel war es, die Variationen der Insulinreaktionen auf einen OGT in einer großen Kohorte von Pferden und Ponies zu beschreiben und einen klinisch anwendbaren Grenzwert für die Bewertung einer ID bei der Quantifizierung des equinen Insulins mit Hilfe des zuvor validierten Insulin ELISA zu generieren. Hierfür wurden die Verläufe der Insulinkonzentrationen von 56 Pferden und Ponies nach einem standard-dosiertem OGT retrospektiv analysiert und ein Grenzwert von 110 µIU/ml nach 120 Minuten berechnet. Somit wurde im Rahmen dieser Untersuchungen der erste Cutoff-Wert als Grundlage für die Diagnose einer ID bei Pferden basierend auf dem OGT-Verfahren und anschließender Bestimmung der Insulinkonzentration mit dem beschriebenen ELISA erarbeitet. Da die Diagnostik einer ID jedoch auch auf der Beurteilung einer IR, als einem Teilaspekt der ID, beruhen kann, wurde im dritten Teil dieses Forschungsprojekts der Einfluss von Insulinmessungen mit zwei verschiedenen Immunoassays in Proben aus einem OGT-Verfahren zur Diagnostik einer ID und in Proben aus einem kombinierten Glucose-Insulin-Tests (CGIT) zur Beurteilung der peripheren IR vorgenommen und verglichen. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurden insgesamt 268 Proben durch den bereits im ersten und zweiten Teil des Forschungsprojektes verwendeten und validierten Insulin ELISA und einem anderen häufig verwendeten human-spezifischen immunradiometrischen Assay (IRMA) analysiert. Besonders das Vorhandensein von endogenem equinem Insulin während des OGT-Verfahrens und des hauptsächlich vorhandenen exogenen Insulins während des CGIT-Verfahrens wurde in dieser Untersuchung genutzt um die Eignung der Immunoassays für den Einsatz in Kombination mit der jeweiligen Diagnostik zu untersuchen. Die Insulinkonzentrationen beider Messverfahren unterschieden sich in den Proben beider Testverfahren signifikant. Die Ergebnisse dieser Untersuchung legen wiederholt nahe, dass die Ergebnisse zwischen diesen beiden Immunoassays ebenfalls nicht als vergleichbar angesehen werden sollten. Insbesondere das Vorhandensein von exogenem Insulin in Proben aus intravenösen Diagnostiktests zur Abklärung einer IR, kann das Ergebnis aufgrund von Kreuzreaktivitäten zwischen den Antikörpern des Immunoassays und den vorhandenen exogenen Insulinmolekülen oder vorhandenen Insulinanaloga beeinflussen. Zusammenfassend zeigen die hier vorliegenden Untersuchungen, dass Insulinkonzentrationen, die mit verschiedenen Methoden gemessen werden, sorgsam unter Berücksichtigung des verwendeten Immunoassays interpretiert werden sollten. Dieses Forschungsprojekt bietet eine Zusammenstellung und kritische Betrachtung verschiedener sich im veterinärmedizinischen Einsatz befindlicher Immunoassays unter Berücksichtigung der speziellen Anforderungen zur Diagnostik einer equinen ID. Auf Grundlage der erhobenen Daten können zuvor definierte Referenzbereiche zwischen verschiedenen Immunoassays verglichen werden und zueinander in Relation gesetzt werden. Außerdem ermöglichen die durchgeführten Untersuchungen Vergleiche zwischen Ergebnissen verschiedenerer bereits publizierter Studien. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse dieser Studie die Bedeutung einer geeigneten und validierten Kombination eines bestimmten diagnostischen Testverfahrens und eines bestimmten Immunoassays im Bezug auf den potenziellen positiven oder negativen Auswirkungen der diagnostischen Aussagekraft auf der Grundlage der immunoassay-spezifischen Eigenschaften der Insulinanalytik.

Equine Metabolic Syndrome (EMS) is an increasing problem and health concern in the equine population. Recent research suggests that insulin dysregulation (ID) with concurrent hyperinsulinemia is the only one among the cluster of signs and symptoms that characterize EMS that is clearly linked to the most common sequel, the development of endocrinopathic laminitis. Insulin dysregulation can manifest in several ways, including basal hyperinsulinemia, an excessive or prolonged hyperinsulinemic response to PO, or IV carbohydrate challenge and/or tissue insulin resistance (IR). The assessment of ID can be challenging, time-consuming and costly in clinical settings. However, it can be achieved by the use of basal or resting blood samples or multiple dynamic stimulation tests focusing on either the identification of ID or tissue IR. Oral glycemic challenges are currently recommended to assess ID and, thereby, identify postprandial hyperinsulinemia under standardized conditions. One example for a standardized PO test is the oral glucose test (OGT). Most of the diagnostic procedures are based on the analysis of insulin concentrations in equine blood samples. However, previous studies indicated marked differences in insulin concentrations obtained from sample analyses with different commonly used immunoassays. Therefore, the main objective of this research project was, firstly, to evaluate the quantification of equine insulin considering the clinical demands and conditions and, secondly, to optimize the assessment of equine ID by a combination of appropriate dynamic diagnostic testing and quantification of equine insulin with a compatible and reliable immunoassay. The first aim of this research project was to compare three commonly used immunoassays for the analysis of equine insulin with a special focus on their assay performance and clinical applicability in assessing ID. The assays investigated are an equine-optimized porcine-specific insulin ELISA, a porcine-specific insulin RIA and a human-specific insulin CLIA. Insulin concentrations obtained by the three investigated immunoassays from the analyses of basal blood samples differed significantly. Analyses of samples obtained during OGT with consecutively higher insulin concentrations revealed significantly lower insulin concentrations supplied by the human-specific CLIA compared to the equine-optimized porcine-specific ELISA. In conclusion, the results indicated that insulin concentrations measured in the same sample by different immunoassays vary greatly and should be interpreted carefully. Based on these findings, the second aim of this research project was to describe the variations in insulin responses to OGT via NGT and the calculation of a clinically useful cut-off value for the assessment of ID when quantifying the equine insulin with the previously validated equine-optimized porcine-specific insulin ELISA. Therefore, insulinemic responses of 56 horses and ponies after standard dosed OGT were analyzed retrospectively and a cutoff value of 110 µIU/mL at 120 min was calculated. Since the assessment of ID can also be based on the assessment of tissue IR, as one aspect of ID, the third aim of this research project was to investigate the influence of insulin analyses performed with two immunoassays in samples obtained during the OGT procedure for the assessment of ID and in samples obtained during CGIT for the assessment of tissue IR. Therefore, a total of 268 samples were analyzed by the previously validated equine-optimized porcine-specific insulin ELISA and another commonly used human-specific IRMA. Particular attention was paid to the presence of endogenous equine insulin during the OGT procedure and mainly exogenous non-equine insulin during IV testing with the combined glucose insulin test (CGIT). Insulin concentrations measured by the equine-optimized porcine-specific ELISA and the human-specific IRMA differed significantly in samples from both diagnostic procedures. The presence of exogenous insulin in samples obtained from IV testing for IR might especially attribute to the variable outcome of sample analyses with different immunoassays due to potential cross-reactivity of the exogenous insulin molecules or analogues with the assays’ antibodies. This research project provides a compilation of different immunoassay comparisons with provision of data for the conversion of insulin concentrations supplied by different immunoassays and for the transformation of previously defined reference ranges between immunoassays. Furthermore, the results of this research project clearly indicate the strength and weaknesses in combining a specific diagnostic protocol with a specific immunoassay method. Thus highlighting the potential positive increase or negative decrease of the tests’ diagnostic value based on the immunoassay-specific characteristics.

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Warnken, Tobias: Comparison of various methods for quantification of equine insulin under clinical settings for assessment of insulin dysregulation. Göttingen 1. Auflage 2019. Cuvillier.

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