Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Monitoring and pathogenesis of flavivirus infections in wild birds and domestic poultry in Germany

Michel, Friederike

Im Laufe der letzten Jahrzehnte kam es aufgrund der zunehmenden Globalisierung und des fortschreitenden Klimawandels zu einem vermehrten Auftreten und der Ausbreitung von Arboviren, in dessen Folge die Gefahr für die menschliche Gesundheit durch Übertragung dieser Viren zunahm. Wildvögel spielen in diesem Zusammenhang eine bedeutende Rolle als Reservoirwirte und/oder Vektoren im Übertragungszyklus endemischer oder neu auftretender viraler Zoonoseerreger in Zentraleuropa. Im Rahmen des weltweiten Vogelzuges können diese Erreger so über weite Strecken transportiert und damit aus Endemiegebieten in neue, bisher freie Gebiete eingeschleppt werden. Das West-Nil-Virus (WNV) ist ein durch Stechmücken übertragenes Virus, welches schwerwiegende Erkrankungen vor allem beim Mensch und Pferd, aber auch verschiedenen Vogelarten auslösen kann. Das Virus ist weltweit verbreitet und wurde erstmals im Jahr 2018 in verschiedenen Vögeln und Pferden in Deutschland nachgewiesen. Das eng verwandte Usutu-Virus (USUV) zirkuliert bereits seit 2010/2011 in Deutschland. Während der letzten Jahre konnte eine zunehmende Ausbreitung innerhalb Deutschlands, assoziiert mit einer erhöhten Vogelsterblichkeit, beobachtet werden. Beide Viren zirkulieren zwischen Vögeln, als Virusreservoir und Mücken, als Vektoren. Monitoringstudien in Wild- und Zoovögeln, sowie der einheimischen Stechmückenpopulation geben wertvolle Hinweise über die Verbreitung neuer und neuartiger Zoonoseerreger. Vor diesem Hintergrund wurde deshalb ein deutschlandweites Wildvogelnetzwerk aufgebaut, um Zug- und Standvögel flächendeckend insbesondere auf die zoonotischen Flaviviren WNV und USUV zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden zum einen Blutproben von lebenden Wild- und Zoovögeln von verschiedenen ornithologisch ausgerichteten Netzwerkpartnern eingesandt. Zum anderen wurden Organproben von verendeten Vögeln, die im Rahmen des WNV Referenzlabors des Friedrich-Loeffler Instituts eingesandt wurden, in diese Studie integriert. Alle diese Wildvogelproben wurden sowohl molekularbiologisch also auch serologisch umfangreich untersucht. Manuskript I und II fassen die Ergebnisse des deutschlandweiten Wildvogelmonitorings der Jahre 2014 bis 2018 zusammen. Im ersten Untersuchungszeitraum von 2014 bis 2016 (n=4), war die Anzahl der USUV positiven Vögel relativ gering, im Vergleich zu den Jahren 2017 und 2018 (n=57). Eine Ausbreitung des USUV nordwärts war allerdings bereits im Lebendvogelmonitoring erkennbar und wurde durch die Daten der an USUV verendeten Vögel untermauert. Besonders im Jahr 2018 kam es zu einer massiven Ausbreitung des USUV in ganz Deutschland verbunden mit einer Vielzahl verschiedener betroffener Vogelarten. Phylogenetische Analysen zeigen eine Ausbreitung der USUV Linien Afrika 3 und Europa 3, und den erstmaligen Nachweis der USUV Linie Europa 2 in Deutschland. Während des gesamten Untersuchungszeitraums wurden neutralisierende Antikörper gegen das USUV vor allem in Standvögeln nachgewiesen, aber auch in Kurz- und Teilstreckenziehern. In den Jahren 2017 und 2018 war ein deutlicher Anstieg der Seroprävalenz gegen das USUV, im Vergleich zu den vorherigen Jahren erkennbar, insbesondere in Regionen in denen das Virus erstmals nachgewiesen wurde. WNV-spezifische RNA konnte in keinem der untersuchten Vögel unseres Lebendmonitorings zwischen 2014 und 2018 nachgewiesen werden, obwohl in verendeten Vögeln und Pferden dieser Nachweis im Jahr 2018 in Deutschland gelang. Neutralisierende Antikörper gegen das WNV wurden vorrangig in Langstreckenziehern gefunden, was mit hoher Wahrscheinlichkeit auf einen Viruskontakt in den südlich gelegenen Winterquartieren hindeutet. Im Jahr 2018 konnten erstmals hohe Antikörpertiter auch in Standvögeln und Kurzstreckenziehern in Ostdeutschland nachgewiesen werden. Diese hohen Antikörper beruhen sehr wahrscheinlich auf einen kürzlich stattgefundenen Kontakt mit dem WNV in diesem Gebiet und sind Anzeichen dafür, dass eine Viruszirkulation in der einheimischen Vogelpopulation vorkommt. Untermauert werden diese ersten serologischen Hinweise aus 2018 nun durch das gehäufte Auftreten von WNV im Jahr 2019 in bereits über 50 Vögeln und bisher 15 Pferden in diesem Bereich. Das Tick-Borne Enzephalitis Virus (TBEV) ist ein weiteres zoonotisches Arbovirus der Gattung Flavivirus. Die mögliche Rolle von Vögeln im Übertragungszyklus dieses Virus ist noch weitgehend ungeklärt, weshalb im zweiten Teil dieser Studie jeweils 20 Hühner intramuskulär und 20 Hühner subkutan mit dem Stamm TBEV Neudoerfl infiziert wurden. Zudem wurden 19 Enten subkutan inokuliert. Die Hühner zeigten keinerlei klinische Symptome. Vereinzelt konnte in einigen Tieren eine Virämie oder Virusausscheidung nachgewiesen werden, jedoch vorrangig in der subkutan inokulierten Gruppe. Die Ergebnisse der infizierten Enten und Hühner waren nahezu identisch. Auch bei den Enten trat keine klinische Symptomatik auf und TBEV-RNA war nur sporadisch in einigen Blut- und Tupferproben nachweisbar. Eine Serokonversion konnten jedoch in allen Hühnern (bis auf einem) und allen Enten nachgewiesen werden. Postmortal gelang in den Hühnern der Nachweis von TBEV-RNA vereinzelt in Gehirn, Herz, Leber und der Zäkaltonsille. Im Gegensatz dazu waren alle infizierten Enten TBEV-RNA positiv im Gehirn und zeigten zudem eine Enzephalitis in der histopathologischen Untersuchung. Außerdem konnte in 14 Enten TBEV-Antigen mittels Immunhistochemie im Gehirn nachgewiesen werden. Da sowohl die Hühner, als auch die Enten keine hohe und langanhaltende Virämie entwickelt haben, spielen diese Vogelspezies sehr wahrscheinlich keine aktive Rolle im Übertragungszyklus des TBE Virus. Jedoch können Hühner und Enten, aufgrund ihrer schnellen Serokonversion und der hohen Antikörpertiter, als Sentineltiere genutzt werden. Serologische Untersuchungen von Wirtschaftsgeflügel in Freilandhaltung (z.B. zum Zeitpunkt der Schlachtung) könnte zusätzlich zur molekularbiologischen Untersuchung von Zecken eingesetzt werden, um neue bisher unentdeckte TBEV Naturherde zu identifizieren. Die hier dargestellten Ergebnisse betonen, dass Monitoring- und Pathogenesestudien an Wildvögeln als Frühwarnsystem für das Auftreten zoonotischer Krankheitserreger eingesetzt werden können. Eine Fortführung des deutschlandweiten Wildvogelmonitorings ist deshalb unerlässlich.

In the last decades several arboviruses emerged, spread and subsequently became a threat to human health due to environmental, climatic and ecological changes. Wild birds play a significant role as reservoir hosts and mechanical vectors for zoonotic pathogens and their dispersal along the major flyways. West Nile virus (WNV) is a mosquito-borne viral pathogen of global importance and can cause severe diseases in humans, horses and several bird species. In 2018, WNV was detected for the first time in birds and horses in Germany. Moreover, an epidemic spread of the closely related Usutu virus (USUV) in birds has been observed in Germany since its first introduction in 2010/2011. Both viruses are maintained in enzootic cycles between birds as virus reservoirs and mosquitoes as vectors, which makes integrated surveillance of birds and mosquitoes an urgent need. Therefore, a nation-wide wild bird surveillance network was set up in order to monitor migratory and resident birds for the zoonotic flaviviruses WNV and USUV. Sample collectors from all over Germany provided blood samples of live wild and zoo birds. Furthermore, organ samples from dead birds submitted to the Friedrich-Loeffler-Institut in 2016 and 2017 were included in this surveillance. All samples were assayed by WNV- and USUV-specific real-time PCRs and serologically by virus neutralization tests. Wild bird monitoring results from 2014 to 2018 in Germany were summarized and evaluated in the first and second manuscript of this cumulative thesis. The number of USUV-RNA positive live birds was rather small (n=4) in the time period of 2014 to 2016, whereas in the following years 2017 and 2018 more viremic cases (n=57) were detected. The expansion of USUV throughout Germany was already seen from data of the live bird sample panel. Furthermore, the locations of dead birds tested positive for USUV illustrated its geographical spread from Southern and Central Germany towards the north. Phylogenetic investigations of these virus genomes showed the presence of USUV lineages Africa 3 and Europe 3 and resulted in the first detection of Europe 2. During the entire investigation period, neutralizing antibodies against USUV were found predominantly in resident birds, but also in partial and short-distance migratory birds. The USUV seroprevalence increased during 2017 and 2018, in particular in regions where USUV had not been detected before. WNV-RNA was not found in the live bird sample panel from 2014 until 2018, despite the first WNV cases in several bird species and in horses in Germany in 2018. During this investigation period, neutralizing antibodies against WNV were found primarily in long-distance migratory birds, indicating a possible virus contact in the winter quarters in Southern Europe or Africa. However, in 2018 high antibody titers were detected for the first time in resident and short-distance migratory birds in Eastern Germany. High antibody titers indicate a recent virus contact, most likely in Germany or neighboring countries and provide evidence for an ongoing WNV circulation in the local bird population. This has become more prominent in 2019 with the occurrence of more than 50 WNV cases in birds and numerous clinically affected horses. Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is another arbovirus of the genus Flavivirus. The role of birds in the transmission cycle of TBEV is not fully understood, hence the second part of the here presented study addresses this topic. For this purpose, 20 chickens were infected intramuscularly (i.m.) and 20 chickens subcutaneously (s.c.) with the TBEV strain Neudoerfl. Furthermore, 19 ducks were inoculated subcutaneously. The chickens did not show any clinical signs. Viremia or virus shedding were observed only sporadically in a few birds, however more often in the subcutaneously infected group. The results were similar for the ducks, which did not show any clinical symptoms either, and TBEV-RNA was detected only occasionally in some blood and swab samples. Nevertheless, all chickens (except one) and all ducks seroconverted. In both groups of chickens (i.m. and s.c.), TBEV-RNA was detected sporadically in different organ samples such as brain, heart, liver and the caecal tonsil. In contrast, in all ducks TBEV-RNA was detected in the brain, and in the histopathology all ducks showed an encephalitis. Furthermore, in 14 ducks, TBEV antigen was found by immunohistochemistry. As chickens and ducks did not develop a high and long-lasting viremia we conclude that they do not play a role as hosts in the transmission cycle of TBEV. Nevertheless, both bird species can be used as sentinel species as they seroconvert fast and develop high antibody levels. The serological investigation of chickens and ducks kept in free-range housing, in addition to the monitoring of TBEV-RNA in ticks, will help to define and detect new natural foci. The here described data emphasizes that monitoring and pathogenesis studies in wild birds can be used as early warning systems for the occurrence of zoonotic pathogens.

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Michel, Friederike: Monitoring and pathogenesis of flavivirus infections in wild birds and domestic poultry in Germany. Hannover 2019. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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