Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Genetische Diversität von Pestiviren und deren Bedeutung für die Bekämpfung der Klassischen Schweinepest

Postel, Alexander

Pestiviren sind hochvariable RNA Viren von großer veterinärmedizinischer Relevanz. Vertreter der etablierten Spezies Bovines Virusdiarrhöe Virus Typ 1 (BVDV-1), Typ 2 (BVDV-2), Border Disease Virus (BDV) und das Virus der Klassisches Schweinepest (KSPV) verursachen Erkrankungen bei Haus- und Wildwiederkäuern sowie bei Schweinen. Aufgrund ihrer wirtschaftlichen Relevanz werden die Klassische Schweinepest (KSP) und die Bovine Virusdiarrhöe (BVD) in Deutschland und in vielen anderen Ländern der Welt staatlich bekämpft. In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl neuer Spezies innerhalb des Genus Pestivirus entdeckt, die sich genetisch erheblich von den etablierten Pestiviren unterscheiden und deren Einfluss auf die Tiergesundheit weitestgehend unbekannt sind. Die genetische Variabilität von Pestiviren hat unterschiedliche Konsequenzen für die Biologie der Erreger, aber auch für die Bekämpfung der von ihnen ausgelösten Tierseuchen. Zum einen führt die genetische Diversität zu erheblichen Unterschieden in den biologischen Eigenschaften, z.B. im Hinblick auf Replikations- und Virulenzeigenschaften, innerhalb ein und derselben Virusspezies. So werden immer wieder Isolate mit außergewöhnlichen genetischen Merkmalen oder besonderen biologischen Eigenschaften beschrieben. Insbesondere aufgrund molekularer Mechanismen wie genetic drift und Rekombination können Krankheitserreger mit neuen Eigenschaften entstehen. Darüber hinaus wurden in den vergangenen Jahren regelmäßig neue Pestivirus-Spezies identifiziert und charakterisiert. Einige dieser neuartigen Pestiviren, die im Zuge von Krankheitsausbrüchen entdeckt wurden, wie zum Beispiel das Bungowannah Virus oder das Linda Virus, sind bislang Einzelnachweise und möglicher Weise das Ergebnis von spillover Infektionen eines unbekannten Reservoirwirtes. Solche Wirtswechsel haben mutmaßlich auch bei der molekularen Evolution von KSPV eine Rolle gespielt und sind auch für andere RNA Viren beschrieben. Vor diesem Hintergrund ist eine Untersuchung von pestiviralen Infektionen in unterschiedlichen Tierarten von großer Bedeutung. Nicht zuletzt spielt für die Tierseuchenbekämpfung die sichere Abgrenzbarkeit von Infektionen mit KSPV zu Infektionen mit anderen Pestiviren eine entscheidende Rolle. Eine Aussage zur Spezifität nachgewiesener Pestivirus-Antikörper bereitet aufgrund von serologischen Kreuzreaktivitäten jedoch oftmals Probleme. Im Rahmen der vorgelegten Arbeit konnte für mehrere Pestiviren, wie z. B. dem „Pronghorn“ Pestivirus, Giraffe-like Pestivirus „PG-2“, dem BDV „Aveyron“ und dem KSPV „Pinar del Rio“, erstmals eine detaillierte genetische Charakterisierung über die Bestimmung und Analyse kompletter Genomsequenzen erfolgen. Ein Teil dieser Viren wurde darüber hinaus in vitro und in vivo auch biologisch näher charakterisiert. Insbesondere Insertionen im NS2 kodierenden Bereich (z. B. bei BDV „Aveyron“) sowie Deletionen oder Insertionen in der 3’NTR (z.B. bei BDV „Aveyron“ und KSPV „Pinar del Rio“) wurden hierbei identifiziert. Derartige Veränderungen im Genom können einen Einfluss auf die Replikation der Viren im Wirt haben sowie auf die Fähigkeit, die angeborene Immunität, die für die initiale Kontrolle der Virusinfektion entscheidend ist, zu beeinflussen. Ein besonderer Schwerpunkt der Arbeit stellte die Charakterisierung von neu entdeckten Pestiviren dar. Hierbei handelte es sich um eine neue Spezies von Pestiviren bei kleinen Wiederkäuern, die vorläufig als Aydin-like Pestiviren bezeichnet wurden, sowie das „atypische porzine Pestivirus“ (APPV). Aydin-like Pestiviren kommen offenbar weit verbreitet bei kleinen Wiederkäuern in der Türkei vor und können Border Disease ähnliche Symptome auslösen. Sie besitzen eine hohe genetische Ähnlichkeit zu KSPV, so dass induzierte Antikörper schwer von KSPV spezifischen Antikörpern zu unterscheiden sind. Damit hätte ein Eintrag solcher Viren in die Schweinepopulation ernste Konsequenzen für den serologischen Nachweis von KSPV Infektionen. Trotz der hohen Ähnlichkeit zu KSPV lösten Aydin-like Pestiviren nach Infektion von Schweinen keine der KSP ähnlichen Krankheitserscheinungen aus, so dass derzeit nicht von einer Gefährdung der Schweinebestände durch diese Viren auszugehen ist. Neben den Aydin-like Pestiviren wurde das neu entdeckte APPV im Rahmen dieser Studie näher untersucht. Mit APPV wurde ein genetisch völlig neuartiges Pestivirus entdeckt, welches offenbar verantwortlich zeichnet für das alt-bekannte klinische Bild des „Ferkelzitterns“ (kongenitaler Tremor). Damit ist der durch APPV induzierte kongenitale Tremor eine wichtige Differentialdiagnose zum kongenitalen Tremor vom Typ AI, welcher durch KSPV ausgelöst wird. Eine klare labordiagnostische Abgrenzung zu Infektionen mit KSPV ist möglich und es gibt derzeit keine Hinweise auf Interferenz von APPV mit den etablierten Nachweisverfahren für KSP. Die durchgeführten epidemiologischen Untersuchungen zeigten eine weite Verbreitung und hohe Prävalenz von APPV, sowohl in klinisch gesunden Hausschweinen, aber auch in Wildschweinen. Retrospektive Untersuchungen und Sequenzanalysen lieferten den Nachweis, dass es sich bei APPV um ein lange in den weltweiten Schweinepopulationen zirkulierendes Virus handelt und nicht um einen neu entstandenen oder vor kurzer Zeit eingeschleppten Erreger. Die genetische Variabilität ermittelter Genomsequenzen ist mindestens so hoch wie bei KSPV. Die großen genetischen Unterschiede zu anderen Pestivirusgenomen, sowie die beobachteten Unterschiede im Zell- und Organtropismus lassen vermuten, dass sich diese neuartigen Pestiviren auch biologisch wesentlich von den seit langem bekannten Pestiviren unterscheiden. In wieweit horizontale Infektionen mit APPV den Gesundheitszustand infizierter Schweine beeinflussen, sowie der Pathogenese- Mechanismus beim Entstehen des kongenitalen Tremors wird Gegenstand weiterer Arbeiten sein. Für den Nachweis von Infektionen mit KSPV und für die verbesserte genetische Charakterisierung von KSPV Isolaten wurden im Rahmen dieser Arbeit unterschiedliche Methoden und neue Strategien entwickelt. Für die verbesserte phylogenetische Charakterisierung von KSPV Isolaten wurde eine Strategie basierend auf der Bestimmung kompletter E2 kodierender Sequenzen etabliert. Entsprechende Datensätze können nun wertvolle unterstützende Informationen für epidemiologische Untersuchungen („molecular tracing“) liefern, da hierdurch auch genetisch sehr ähnliche Isolate diskriminiert werden können. Die Methode wurde u.a. bereits für die Charakterisierung von Ausbruchsisolaten aus Litauen, Nepal und Kuba erfolgreich eingesetzt. Die KSPV Sequenzdatenbank des EURLs und die dort eingebetteten Sequenzanalyse-Programme wurden der neuen Strategie angepasst, so das nun auch längere Sequenzen und komplette KSPV Genomsequenzen gespeichert und verarbeitet werden können. Des Weiteren wurden auch neue diagnostische Verfahren für den Nachweis von KSPV Infektionen entwickelt und evaluiert. Zum einen wurde ein Alternativverfahren zur klassischen KSPV Isolierung etabliert, welches auf dem Prinzip der Transfektion viraler RNA beruht. Dieser methodische Ansatz kann sich als vorteilhaft erweisen insbesondere bei kontaminiertem Probenmaterial oder Genom-positiven Proben, die gleichzeitig neutralisierende Antikörper enthalten. Darüber hinaus wurde ein molekularbiologischer Test für den Nachweis des endemisch auf Kuba zirkulierenden KSPV Subgenotyps 1.4 entwickelt. Diese einstufige isothermale PCR mit reverser Transkription basiert auf dem LAMP-Prinzip und soll als on-site Test für den KSPV Genomnachweis in den kubanischen Regionallaboren Anwendung finden. Schlussendlich wurde im Rahmen dieser Arbeit ein KSPV Antikörper-ELISA entwickelt, der nach Anwendung eines zugelassenen KSP Markerimpfstoffes eine Diskriminierung von geimpften Schweinen und Tieren mit einer Feldinfektionen (DIVA-Prinzip) erlaubt. Insbesondere unerwünschte Kreuzreaktionen mit Antikörpern, die durch Infektionen mit anderen Pestiviren induziert werden, stellen hierbei nach wie vor ein Problem dar. Möglicher Weise ist die relativ enge genetische und damit antigene Verwandtschaft zwischen BVDV und KSPV limitierend, um ein robustes Markerprinzip zu erhalten (serologischer Negativmarker). Die Kenntnis neuer Pestiviren, die sich serologisch von KSPV deutlicher unterscheiden, kann hier helfen, neue chimäre Pestiviren und auf deren Basis verbesserte Impfstoffe mit robusteren Markereigenschaften zu entwickeln. Die genetische Variabilität einerseits und die zum Teil ausgeprägten Kreuzreaktivitäten andererseits sind große Herausforderungen bei der Diagnose von Pestivirusinfektionen und werden es auch in Zukunft sein. Neue diagnostische Methoden, effizientere Methoden der Nukleinsäuresequenzierung sowie verbesserte Verfahren der Erregertypisierung werden zukünftig dazu beitragen, Ausbruchsisolate schneller zu identifizieren und besser zu charakterisieren. Die komplexen Interaktionen von Pestiviren mit ihren Wirten sind bislang wenig verstanden. Die zunehmende Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Sequenzinformationen in Verbindung mit der biologischen Charakterisierung neuer Pestiviren wird einen wichtigen Beitrag leisten, mögliche genetische Determinanten zu identifizieren, die für bestimmte Erregereigenschaften verantwortlich zeichnen. Ein besseres Verständnis der molekularen Determinanten für Virulenzeigenschaften und Attenuierung kann wiederum zur Entwicklung neuer innovativer Lebendimpfstoffe beitragen. Insbesondere eröffnet auch die Entdeckung genetisch neuartiger Pestiviren neue Perspektiven für die Weiterentwicklung von Markerimpfstoffen basierend auf dem Konzept chimärer Pestiviren. Die Abkehr von einer auf Keulung basierenden KSP Bekämpfung hin zu einer modernen, Ressourcenschonenden Bekämpfungsstrategie, die im Ausbruchsfall die Verwendung von Markerimpfstoffen einschließen kann (vaccination-to-live), sollte als gesellschaftliches Ziel definiert und von den Tierärzten vertreten werden.

Pestiviruses are highly variable RNA viruses of outstanding veterinary relevance. Members of the established species Bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), BVDV type 2 (BVDV-2), Border disease virus (BDV) and Classical swine fever virus (CSFV) are causative agents for diseases in domestic and wild ruminants as well as in pigs. Due to their enormous economic relevance, classical swine fever (CSF) and bovine viral diarrhea (BVD) are controlled by mandatory control programs in Germany and many other countries worldwide. In the recent years, numerous novel virus species have been discovered within the genus Pestivirus, which are genetically very distinct to the established pestiviruses and have a so far undetermined influence on the animals’ health status. Genetic variability of pestiviruses has different consequences for the pathogen’s biological characteristics, but also for the control of the induced diseases. On the one hand, genetic diversity results in prominent differences in the biological properties even within the same viral species, e.g. with regard to viral replication and virulence. This is demonstrated by the ongoing description of novel isolates with genetic alterations and changed biological features. In particular, evolution of already known pestiviruses by molecular mechanisms like genetic drift and recombination can lead to emergence of pathogens with new properties. On the other hand, there is continuous reporting about identification and characterization of novel pestiviruses. Some of these novel pestiviruses that have been identified within disease outbreaks, like e.g. the Bungowannah virus or the Linda virus, so far have occurred as single events and are putative results of a spill-over infection from a so far unknown host. Such host switches have putatively played also a role in the evolution of CSFV and have been also described for other RNA viruses as well. Against this background, the investigation of pestiviral infections in different host species is of utmost importance. Finally, the discrimination between CSFV infections and infections with related pestiviruses plays a crucial role in animal disease control. In particular, determining the specificity of detected pestiviral antibodies is often challenging due to cross-reactivity between pestivirus-induced antibodies. In the framework of the presented work it was possible to provide detailed genetic characterization by determining the complete genome sequences of several pestiviruses, comprising e.g. pronghorn pestivirus, Giraffe-like pestivirus “PG-2”, BDV “Aveyron” and CSFV “Pinar del Rio”. In addition, some of these viruses were also characterized in vitro and in vivo to determine their biological properties. In particular, insertions in the NS2 coding regions (e.g. in BDV „Aveyron“ and in Giraffe-like pestivirus „PG-2“) and deletions or insertions in the 3`NTR (e.g. in BDV „Aveyron“ and KSPV „Pinar del Rio”) have been identified. Such alterations in the genome may influence the viral replication in the host and can alter the ability to suppress the innate immune response, which is a crucial principle to initially control the virus infection. Focus of the work was the characterization of newly discovered pestiviruses. This includes mainly a novel pestivirus species identified in small ruminants from turkey, which was tentatively designated Aydin-like pestivirus as well the newly discovered “atypical porcine pestivirus” (APPV). Aydin-like pestiviruses obviously are widely distributed in Turkey and are capable to induce Border Disease-like symptoms. They possess a close genetic relatedness to CSFV, which makes the induced antibodies hardly distinguishable from CSFV specific antibodies. Against this background, an introduction of these viruses into the pig population would have serious consequences for the serological identification of CSFV infections. Despite the close similarity to CSFV, Aydin-like pestiviruses were not able to induce CSF-like symptoms in pigs, so that at the moment these novel pestiviruses seem not to be a threat to the pig populations. In addition to Aydin-like pestiviruses, the newly discovered APPV was investigated in detail. APPV represents a genetically distinct pestivirus species that is obviously causing agent of the well-known „shaking piglets“ syndrome (congenital tremor). Against this background, the APPV induced congenital tremor can clinically not be differentiated from congenital tremors of type AI, which is induced by CSFV. A save discrimination to infections with CSFV was possible by laboratory diagnosis. Currently there is no evidence for interference of APPV with established procedures of CSF diagnosis. Furthermore, epidemiological investigations revealed a wide distribution und high prevalence also in healthy domestic pigs as well as in wild boar. Retrospective detection of APPV and sequence analyses demonstrated that APPV probably is circulating in the pig population for long time and is not a newly introduced or emerged pathogen. Genetic variability of known genome sequences is comparable to that of CSFV. High genetic differences to known pestiviruses as well as the overserved differences in cell- and organ tropism indicate that also biological properties of these atypical pestiviruses probably are different to what is known from established pestiviruses. The impact of APPV infections on the general health status of pigs and the mechanism of pathogenesis for the induction of congenital tremors will be aim of future studies. For the detection of CSFV infections and for improved genetic characterization of CSFV isolates diverse methods and novel strategies have been developed. For improved phylogenetic characterization of CSFV isolates, a strategy based on complete E2 encoding sequences was implemented. As even highly similar isolates can be discriminated by this approach now, such data sets can provide valuable information for supporting epidemiological investigations (“molecular tracing”). This method was already successfully applied in the context of pathogen characterization of CSF outbreaks, e.g. in Lithuania, Nepal and Cuba. The CSFV sequence database of the EURL and the embedded software tools for sequence analyses have been adapted accordingly, being suitable now also for processing of longer sequence including complete genomic sequences. In addition to the improved strategy for genetic typing, several new methods for the detection of CSFV infections have been developed and evaluated. On the one hand an alternative method to conventional virus isolation was established, which is based on the electroporation of viral RNA. This approach can be advantageous for contaminated sample material or genome positive material that contains neutralizing antibodies at the same time. In addition, a molecular test was designed and evaluated for detection of the CSFV subgenotype 1.4, which is endemic on Cuba. This isothermal one-step reverse transcription PCR is based on the LAMP-principle and shall be applied as on-site test in the Cuban regional laboratories. Finally, a CSFV specific antibody ELISA was developed in this study, which can be used to discriminate between vaccinated pigs and field infections (DIVA principle) after application of the licensed CSF marker vaccine. In particular, interference of cross-reactive antibodies induced after infections with other pestiviruses still are problematic. It is likely that the relative close genetic relationship between BVDV and CSFV limits the possibilities to establish a robust marker principle (serological negative marker). The knowledge about novel, genetically distinct pestiviruses will provide new possibilities to create novel chimeric pestiviruses that might be suitable to develop improved pestivirus marker vaccines. With regard to the diagnosis of pestivirus infections, genetic variability on the one hand and the prominent cross reactivity between certain pestiviruses on the other hand are challenging and also will remain a challenge in the future. New diagnostic methods, more efficient approaches in sequence determination as well as improved strategies for pathogen characterization will contribute to a faster identification of outbreak isolates and a better pathogen characterization. The complex interactions of pestiviruses and their hosts are still poorly understood. The increasing availability of high quality sequence information in combination with a biological characterization of novel pestiviruses will make a major contribution to identify possible molecular determinants for virulence properties and attenuation, what might give rise to the development of new innovative live vaccines. In particular, the more recent discovery of novel genetic distinct pestiviruses provides new perspectives to develop a next generation of improved marker vaccines based on the chimeric pestivirus concept. The change from CSF control based on a strict culling strategy towards a modern, resource-saving control strategy that can include the application of marker vaccines (vaccination-to-live) should be defined as a common aim of our society and should be actively supported by veterinarians.

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Postel, Alexander: Genetische Diversität von Pestiviren und deren Bedeutung für die Bekämpfung der Klassischen Schweinepest. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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