Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Interspezies-Übertragung fledertierassoziierter RNS-Viren

Krüger, Nadine

Die Interspezies-Übertragung von Mikroorganismen setzt voraus, dass die Erreger nicht nur in der Lage sind, die Zielzellen der neuen Wirtsspezies zu infizieren, sondern sich auch erfolgreich in diesen zu vermehren. Der erste Schritt des viralen Replikationszyklus beinhaltet den Eintrittsprozess und setzt bei behüllten Viren zum einen das Vorhandensein geeigneter zellulärer Rezeptoren auf Zielzellen voraus, zum anderen muss das fusions-vermittelnde Protein durch proteolytische Spaltung und Konformationsänderungen vollständig aktiviert werden, damit es die Fusion zwischen Virus- und Zellmembran bewirken kann. Im Anschluss finden Transkription und Replikation des viralen Genoms statt. Während diese beiden Schritte im Fall der RNS-Viren durch die viruseigene RNS‑Polymerase bewerkstelligt werden, sind für die Ausführung der anschließenden Translation und der posttranslationalen Modifikationen zelluläre Faktoren verantwortlich. Zudem sind Mechanismen zum Umgehen der angeborenen Immunantwort für Viren von großer Bedeutung, da ansonsten die Erkennung von Mikroorganismen zum Ablauf von Signalkaskaden und damit zur Aktivierung der antiviralen Immunantwort führt. Jeder einzelne Schritt des viralen Replikationszyklus stellt eine Barriere dar, welche für eine erfolgreiche Interspezies-Übertragung überwunden werden muss. Während bei einigen Viren das Überwinden einzelner oder mehrerer Barrieren kein Hindernis darstellt, müssen bei anderen Viren zunächst Adaptationen an die neue Wirtsspezies stattfinden. Je weniger Adaptationen erforderlich sind, umso größer ist das Risiko, dass ein Virus auf eine neue Spezies übertragen wird und sich in dieser ausbreiten kann. Untersuchungen zur Funktionalität des Fusions- (F) und des rezeptor-bindenden Glykoproteins (G) des KuV zeigten, dass die für Henipaviren typische Zellfusion in diesem Fall auf Zelllinien von Fledertieren beschränkt ist. Weitere Untersuchungen zeigten, dass das G Protein nur unzureichend zur Oberfläche transportiert und hauptsächlich im ER zurückgehalten wird. Obwohl in Fledertierzellen ebenfalls eine Retention im ER vorlag, war die absolute Oberflächenexpression des KuV G in diesen Zellen deutlich höher als in Säugetierzellen, in denen keine Zellfusion beobachtet wurde. Da bei Paramyxoviren eine Interaktion zwischen F und G für die Konformationsänderungen im F‑Protein notwendig ist, ist davon auszugehen, dass die unzureichende Expression des G‑Proteins an der Zelloberfläche für die spezies-spezifische Zellfusion verantwortlich ist. Für die fledertierassoziierten Influenzaviren wurde ebenfalls eine Speziesrestriktion in Bezug auf den Eintrittsprozess festgestellt. Mit Hilfe viraler Pseudotypen wurden die beiden Hüllproteine HL und NL näher untersucht. Diese konnten nur den Eintritt in Flughundzellen, nicht jedoch in andere Säugetierzellen vermitteln. Da des Weiteren gezeigt wurde, dass in allen Zelllinien die zellulären Faktoren vorliegen, welche zur Aktivierung des fusions‑vermittelnden HL-Proteins notwendig sind, ist zu vermuten, dass die Restriktion auf das Fehlen geeigneter zellulärer Rezeptoren in diesen Zellen zurück zu führen ist. Das fledertierassoziierte Mumpsvirus ähnelt den humanen Mumpsviren nicht nur phylogenetisch, sondern auch funktionell und antigenetisch. Da dieses Virus effizient in humanen Zellen repliziert, sich bezüglich des Eintrittsprozesses nahezu identisch zu humanen Mumpsviren verhält, sowohl die IFN- als auch die NF-κB-induzierte Immunantwort in humanen Zellen umgehen kann und in einem Tiermodel neurovirulente Eigenschaften zeigt, ist davon auszugehen, dass dieses Virus in der Lage ist, ohne weitere Adaptationen den Menschen zu infizieren und sich innerhalb dieser Spezies auszubreiten. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit die spezies-übergreifende Wirkung des antiviralen Faktors Tetherin untersucht. Durch die Erzeugung virus-ähnlicher Partikel wurde gezeigt, dass das humane Tetherin durch die antagonisierenden Proteine von HIV und EBOV in seiner Funktion gehemmt werden konnte. Im Gegensatz hierzu war das Flughund-Tetherin resistent gegenüber dem antagonisierenden HIV-Protein. In Infektionsstudien mit den fledertierassoziierten Viren EBOV und NiV und dem zoonotischen VSV wurde gezeigt, dass die Ausbreitung von VSV und NiV durch endogen exprimiertes Fledertier-Tetherin substantiell gehemmt wird, während so gut wie kein antiviraler Einfluss auf die Replikation von EBOV festgestellt wurde.

The interspecies transmission of microorganisms requires the ability of a pathogen to enter target cells of a new host species and to efficiently replicate in these cells. The first step of the viral lifecycle comprises the entry process that requires the expression of suitable cellular receptors on the cell surface and - in the case of enveloped viruses - the activation of the fusion protein by proteolytic processing and conformational changes to be capable of mediating fusion between viral and cellular membranes. Whereas the replication and transcription of the viral genome of RNA viruses is mediated by the viral RNA polymerase, the subsequent translation and posttranslational modifications of newly synthesized viral proteins depend on the activity of cellular factors. Furthermore, mechanisms to evade innate immunity are important, because the recognition of microorganisms triggers signaling cascades that result in the activation of the antiviral immune response. Every single step of the viral lifecycle can represent a barrier that has to be overcome for successful interspecies transmission. Whereas some viruses can overcome one or several barriers without any adaptation process, other viruses need to adapt to the new host species first. The fewer adaptations are required, the greater the risk that a virus can be transmitted to and spread within a new host species population. Investigations on the functionality of the fusion (F) and attachment glycoproteins (G) of KuV revealed that the cell-to-cell fusion, that is typical for henipavirus infections, was restricted to cell lines of bat origin. Further experiments showed that the cellular transport of KuV G to the cell surface is inefficient and that most of this protein is retained inside the ER. Although the majority of KuV G accumulates in the ER in bat cells as well, the total surface expression levels in these cells are significantly higher compared to cells that do not show any cell-to-cell fusion. Given that among paramyxoviruses a close interaction between F and G is required to induce the conformational changes in F, it is suggested, that the inefficient transport to the cell surface and thus low surface expression level of KuV G contribute to the restricted, species‑specific fusogenicity. Also for bat-derived FLUAV a species restriction at the stage of the viral entry process has been determined. To investigate the surface glycoproteins HL and NL, a viral pseudotype system has been employed. Entry of viral pseudotypes was only achieved in cell lines of bat origin, but not in other mammalian cell lines. Further investigations showed, that the cellular factors that are required for the activation of the fusion-mediating HL protein are available in all cell lines analyzed, suggesting that the restriction most likely relies on the absence of suitable cellular receptors. The bat-derived mumps virus is not only phylogenetically related to hMuVs but also displays a functional and antigenetic relatedness. Given that this virus efficiently replicates in human cells, utilizes identical molecular mechanisms for the viral entry process as hMuVs, can circumvent the IFN- as well as the NF‑κB‑induced immune response in human cells and exhibits neuropathogenic properties in an animal model, it is very likely that this virus might be transmitted to humans and spread within this species without any further adaptations. In addition, this thesis investigated the interspecies functionality of the antiviral factor tetherin. By the generation of virus-like particles it has been shown, that human tetherin can be inhibited by the antagonistic proteins of HIV and EBOV. Contrarily, tetherin orthologous derived from two fruit bat species were resistant against antagonism by HIV Vpu. Infection studies using the bat-associated viruses EBOV and NiV as well as the zoonotic pathogen VSV revealed that endogenous fruit bat tetherin could efficiently inhibit viral spread of VSV and NiV, whereas almost no inhibitory effect against EBOV was obtained.

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Krüger, Nadine: Untersuchungen zur Interspezies-Übertragung fledertierassoziierter RNS-Viren. Hannover 2019. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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