Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Abbau von β-Laktamantibiotika in Hemmstoffmilch

Renner, Romina Wilhelmine

Auf die Behandlung von Mastitiden entfallen 68 % der in der Milchviehwirtschaft insgesamt eingesetzten Antibiotika. Die Mastitistherapie erfolgt i.d.R. durch die lokale Applikation von Euterinjektoren in die Milchdrüse. Dabei kommen insbesondere Wirkstoffe aus der Klasse der β-Laktamantibiotika, also Penicilline und Cephalosporine, zur Anwendung, da sie eine gute Wirksamkeit bei einer aktuell entspannten Resistenzlage aufweisen (S. aureus-Mastitiden ausgenommen). Während und auch noch einige Zeit nach der lokalen antibiotischen Therapie können im Falle von Penicillin G fast 50 % der applizierten Dosis unverändert über die Milch ausgeschieden werden. Bei der Behandlung aller vier Viertel kann die ausgeschiedene Menge an Penicillin G in Abhängigkeit vom Melkintervall bei einer Konzentration von 25 mg/kg Penicillin G in der Milch liegen. Antibiotikahaltige Milch wird als Hemmstoff- oder Sperrmilch bezeichnet und darf nicht in die Lebensmittelkette gelangen. Zum Schutz der Verbraucher wurden aus diesem Grund in der VO (EU) Nr. 37/2010 MRL-Werte für antibiotische Rückstände in Lebensmitteln tierischer Herkunft festgelegt, deren Einhaltung in den Molkereien überprüft wird. Der gesetzlich vorgeschriebene MRL-Wert für Penicillin G in Milch liegt bei 4 µg/kg. Die Entsorgung der Hemmstoffmilch erfolgt zum einen über das Ausbringen mit der Gülle auf landwirtschaftliche Flächen oder durch die Verwendung als Kälbermilch für die Nachzucht auf dem Betrieb. Beide Praktiken sind mit negativen Auswirkungen auf die Umwelt und das Ökosystem behaftet. Das Ausbringen auf landwirtschaftliche Flächen führt zu einer Anreicherung von antibiotischen Rückständen im Erdboden, die potentiell das Grundwasser erreichen können oder sich in auf diesen Flächen angebauten Nutzpflanzen anreichern und somit in die Lebensmittelkette gelangen können. Schwerer wiegt jedoch die Tatsache, dass antibiotische Rückstände einen großen Einfluss auf das Mikrobiom der im Erdboden befindlichen Bakterien haben und ihre Anwesenheit über längere Zeiträume in subtherapeutischen Dosen nachweislich zur verstärkten Übertragung von Resistenzgenen zwischen den dort lebenden Bakterien führt. Die Verwendung antibiotikahaltiger Milch als Kälbertränke ist ein potentieller Risikofaktor für die Selektion antibiotikaresistenter Bakterien im Darm der Kälber. Im Kot von mit Hemmstoffmilch gefütterten Kälbern wurde bereits nach einer kurzen Expositionsdauer ein erhöhtes Vorkommen resistenter E.coli-Bakterien festgestellt. Welche weiteren negativen Auswirkungen diese Praxis langfristig auf die Gesundheit der Kälber hat, ist weitgehend noch unklar. In Anbetracht der immer weiter zunehmenden Problematik mit resistenten oder gar multiresistenten Bakterien sollte versucht werden, den Eintrag antibiotischer Rückstände in die Umwelt zu reduzieren, um einer beschleunigten und verstärkten Entwicklung von Resistenzen entgegenzuwirken. In der Veterinärmedizin wurde der Einsatz von Cephalosporinen der 3. und 4. Generation durch die Änderung der TÄHAV im März 2018 eingeschränkt. Dies wird in Zukunft zu einem verstärkten Einsatz von Schmalspektrum-Antibiotika aus der Klasse der Penicilline führen, was wiederum dauerhaft Einfluss auf die Resistenzentwicklung gegenüber dieser Wirkstoffklasse haben könnte. Die vorliegende Arbeit verfolgt das Ziel, eine Abbaumethode für β-Laktamantibiotika, zunächst für Penicillin G, zu entwickeln, mit der die im Rahmen einer lokalen Mastitisbehandlung zu erwartende Penicillin G-Konzentration in der Milch abgebaut werden kann. Diese Methode sollte schnell und einfach auf den Milchviehbetrieben durch den Landwirt durchführbar sein und die Konzentration von Penicillin G unter den gesetzlichen MRL-Wert von 4 µg/kg abbauen. Des Weiteren sollte die Methode nicht mit großem Arbeitsaufwand oder Risiken für die Umwelt oder die Gesundheit des Anwenders verbunden und dabei möglichst kostenschonend sein. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Abbau von Penicillin G durch die physikalisch-chemischen Methoden Erhitzung, Anwendung von Säure sowie Wasserstoffperoxid, während sich der zweite Teil der Arbeit dem enzymatischen Abbau durch β-Laktamasen widmet. Grundsätzlich erfolgt der Abbau aller β-Laktamantibiotika über die Öffnung des β-Laktamringes, der das aktive Zentrum darstellt und für die antibiotische Aktivität verantwortlich ist. Folglich bedingt die Öffnung der Ringstruktur den Verlust der antibiotischen Aktivität. Chemisch gesehen handelt es sich dabei um eine Hydrolyse der Ringstruktur. Als erstes wurde die alleinige Erhitzung von Milch mit 4 µg/kg Penicillin G bei Temperaturen bis zu 95 °C untersucht. Durch die Einwirkung von 95 °C für 120 Minuten konnte jedoch nur ein maximaler Abbau von 4 µg/kg Penicillin G erzielt werden. Da ein alleiniger Erhitzungsvorgang keine ausreichende Inaktivierung von Penicillin G erbrachte, wurde ein kombiniertes Verfahren aus Herabsetzen des Milch-pH-Wertes (pH 4,0, 4,5, 5,0, 5,5) mit Milchsäure sowie anschließender Erhitzung bei verschiedenen Temperaturen von 75 °C bis 90 °C für unterschiedliche Zeitintervalle angewendet. Hier zeigte sich, dass der Abbau von Penicillin G in Milch umso besser funktioniert, je höher die Erhitzungstemperatur, je niedriger der pH-Wert in der Milch und je länger die Erhitzungszeit ist. Jedoch erwiesen sich nur die pH-Werte 4,0 und 4,5 sowie die Erhitzungstemperaturen von 80 °C und 90 °C als geeignet, um einen Abbau von Penicillin G im erforderlichen mg/kg-Bereich zu erreichen. In Milch mit einem pH-Wert von 4,0 können beispielsweise durch eine 90-minütige Erhitzung bei 80 °C 64 mg/kg Penicillin G abgebaut werden, während es unter denselben Bedingungen bei 90 °C bereits 100 mg/kg sind. Für Milch mit einem pH-Wert von 4,5 lassen sich nur durch die Erhitzung bei 90 °C gute Abbauergebnisse erzielen. So werden nach 90-minütiger Erhitzung 64 mg/kg abgebaut. Für beide pH-Werte ist durch eine Erhitzung bei 90 °C für 120 Minuten der Abbau von deutlich höheren Penicillin G-Konzentrationen möglich. Für die Anwendung dieser Methode auf Milchviehbetrieben ist eine apparative Ausstattung nötig, die das Erhitzen von Milch auf 90 °C ermöglicht. Dies ist in einigen Milchtaxis für Kälber möglich, die normalerweise nur zur Pasteurisierung von Milch genutzt werden und mittlerweile auf sehr vielen Milchviehbetrieben vorhanden sind. Das Verfahren aus Ansäuern und Erhitzen der Milch ist an sich einfach und schnell durchführbar, jedoch durch die langen Erhitzungszeiten bei hohen Temperaturen energie- und somit kostenintensiv, weshalb diese Methode auf freiwilliger Basis bei den Landwirten wahrscheinlich wenig Anklang finden wird. Hinzu kommt, dass sich eine Verwendung der angesäuerten Milch als Sauermilchtränke für Kälber schwierig gestalten könnte, da ein pH-Wert von 5,5 für eine gute geschmackliche Akzeptanz nicht unterschritten werden sollte. Somit kann die mit dieser Methode behandelte Milch sehr wahrscheinlich lediglich über die Gülle entsorgt werden. Ein dritter physikalisch-chemischer Abbauversuch, bei dem Penicillin G-haltige Milch mit Wasserstoffperoxid versehen und nach einer Inkubationszeit ebenfalls erhitzt wurde, konnte gar keinen Abbau des Antibiotikums erzielen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden aus in der Hochschule Hannover aus Mastitismilchroben isolierte coliforme Bakterien mit einem auffälligen Resistenzspektrum gegenüber verschiedenen β-Laktamantibiotika mit dem Double Disk Approximation Test nach Jarlier auf die Produktion von ESBL überprüft. Die acht positiv auf ESBL-Bildung getesteten Bakterien wurden dann mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie als E. coli-Stämme identifiziert. Im nächsten Schritt wurde versucht, die β-Laktamasen dieser Stämme während ihrer Anzucht in Hirn-Herz-Bouillon zu verschiedenen Zeitpunkten ihres Wachstums bei 37 °C durch sterile Filtration zu gewinnen. Dabei zeigte sich, dass die Enzymproduktion dieser E. coli-Stämme nicht – wie in der Literatur beschrieben – verstärkt durch eine Konzentration von 10 mg/kg Penicillin G in der Hirn-Herz-Bouillon induzierbar war. Die einzige logische Erklärung dafür scheint ein verzögertes Wachstum der Bakterien in Gegenwart von Penicillin G zu sein. Dies ist jedoch auf Grund der Tatsache, dass es sich bei den verwendeten E. coli-Stämmen um ESBL-Bildner mit Resistenz gegenüber Penicillin G handelt, wenig wahrscheinlich. In dieser Arbeit wurde nach dieser Feststellung auf die Zugabe von Penicillin G in der Hirn-Herz-Bouillon verzichtet, allerdings sollte die Ursache für den ausbleibenden stimulierenden Effekt näher untersucht werden und es sollten gegebenenfalls geringere Penicillin G-Konzentrationen zur Stimulation getestet werden. In den durchgeführten Versuchen konnte nachgewiesen werden, dass die aus den E. coli-Stämmen gewonnenen Filtrate ab einem für jeden Stamm individuellen Zeitpunkt ihrer exponentiellen Wachstumsphase β-Laktamasen enthalten, die bei der Anwendung in Milch bei 37 °C unterschiedliche Inkubationszeiten benötigen, um 25 mg/kg Penicillin G abzubauen. Insgesamt waren Enzymlösungen aus drei der acht E. coli-Stämme dazu geeignet diese Penicillin G-Konzentration in einer möglichst kurzen Inkubationszeit abzubauen. 25 mg/kg Penicillin G in Milch konnten bei 37 °C innerhalb von 2 Stunden durch zu folgenden Wachstumszeitpunkten aus Hirn-Herz-Bouillon gewonnenen Enzymlösungen abgebaut werden: Die Enzymlösung aus E. coli-Stamm 7124, 13111 und 15072 konnten nach 3,5 Stunden, 4,0 Stunden sowie 4,5 Stunden und bei einer optischen Dichte von 1,1, 1,13 sowie 1,24 gewonnen werden. Die benötigte Menge an Enzymlösung beträgt 0,5 % bezogen auf die Menge der zu bereinigenden Milch. Dass die β-Laktamasen der E. coli-Stämme durch steriles Filtrieren aus der Hirn-Herz-Bouillon gewonnen werden konnten, ist insofern interessant, dass die β-Laktamasen gramnegativer Bakterien der einschlägigen Literatur zufolge im periplasmatischen Raum, das heißt also in der Bakterienzelle, lokalisiert sein sollen, wohingegen grampositive Bakterien die Enzyme überwiegend in das sie umgebende Medium abgeben. Dies kann jedoch hier nicht der Fall sein, da eine Gewinnung durch Filtration dann nicht möglich gewesen wäre. Eine Freisetzung der in der Enzymlösung enthaltenen β-Laktamasen aus abgestorbenen Bakterien wäre zwar denkbar, allerdings handelt es sich aller Wahrscheinlichkeit nach um eine aktive Sezernierung der Enzyme in das Nährmedium, da in der exponentiellen Wachstumsphase nur einige wenige Bakterien absterben und dadurch mit Sicherheit keine ausreichende Konzentration an β-Laktamasen in der Enzymlösung vorhanden wäre, um 25 mg/kg Penicillin G innerhalb von nur 2 Stunden in Milch abzubauen. Die Mechanismen der Enzymfreisetzung der verwendeten E. coli-Stämme sollten daher in jedem Fall Gegenstand weiterer Untersuchungen sein. Die drei oben genannten Enzymlösungen wurden im Anschluss hinsichtlich ihres Temperatur- sowie pH-Wert-Optimums, ihrer Thermostabilität sowie ihrer Haltbarkeit bei unterschiedlichen Lagerungsbedingungen analysiert. Die höchste enzymatische Aktivität liegt bei einer Umgebungstemperatur zwischen 25 °C und 37 °C und das bevorzugte pH-Wert-Milieu liegt im schwach sauren (maximal pH-Wert 5,5) bis neutralen Bereich. Die Denaturierung erfolgt bei der Enzymlösung aus E. coli-Stamm 7124 nach 15 Minuten bei 60 °C und bei den anderen beiden Enzymlösungen bereits bei 50 °C. In tiefgefrorenem Zustand bei -18 °C ist eine mindestens vierwöchige Lagerung ohne enzymatischen Aktivitätsverlust möglich, wohingegen eine Lagerung im Kühlschrank bei den Enzymlösungen aus E. coli-Stamm 7124 und 1311 maximal 4 Wochen und bei Raumtemperatur maximal 3 Wochen möglich ist. Die Enzymlösung aus E. coli-Stamm 15072 kann sowohl im Kühlschrank als auch bei Raumtemperatur höchstens 4 Wochen gelagert werden. Zwar stellt das Einfrieren und Wiederauftauen der Enzymlösungen kein Problem dar, jedoch sollte dieser Vorgang nicht mehr als drei Mal durchgeführt werden, da dies zu einer deutlichen Verringerung der enzymatischen Aktivität führt. Der Versuch, die Enzymlösungen durch Gefriertrocknung auch für längere Zeiträume haltbar zu machen, war nicht erfolgreich bzw. war ebenfalls mit einer verminderten enzymatischen Aktivität verbunden. Das Verfahren der Gefriertrocknung wird unter anderem in der Pharmazie sehr häufig angewendet, um Substanzen ohne Verlust ihrer typischen Eigenschaften schonend für lange Zeit haltbar zu machen. Dies könnte insbesondere im Hinblick auf die Entwicklung eines verkaufsfähigen Produktes aus den Enzymlösungen von großer Bedeutung sein. Daher sollte genauer untersucht werden, warum die Gefriertrocknung hier nicht erfolgreich war. So könnte beispielsweise der Verwendung von Kryoprotektoren eine entscheidende Rolle zukommen. Die Anwendung der aus den drei E. coli-Stämmen gewonnenen Enzymlösungen in Hemmstoffmilch ist vielversprechend, allerdings muss darauf hingewiesen werden, dass ihre Wirksamkeit bisher nur in Penicillin G-haltiger Milch getestet wurde und der Abbau weiterer Substanzen aus der Klasse der β-Laktamantibiotika unbedingt untersucht werden muss. Für eine Verwendung der Enzymlösungen auf Milchviehbetrieben ist der Abbau von Penicillinen und Cephalosporinen gleichermaßen relevant und stellt die Voraussetzung für die Herstellung eines Produktes im großen Stil dar. Damit die Umweltsicherheit eines solchen Produktes gewährleistet ist, muss außerdem sichergestellt werden, dass in den Enzymlösungen keine anderen bakteriellen Bestandteile wie zum Beispiel Plasmide aus abgestorbenen Bakterien vorhanden sind. Da ihre Größe im nm-Bereich liegt, können sie die in dieser Arbeit verwendeten Filter, die Partikel mit einer Größe von über 0,2 µm zurückhalten, problemlos passieren. Der Eintrag von Plasmiden in die Umwelt bzw. das Aufnehmen durch die Kälber über die Milch muss in jedem Fall vermieden werden, da andere Bakterien die Plasmide mit den auf ihnen enthaltenen Resistenzgenen über den Mechanismus der Transformation aufnehmen und somit ihr Resistenzspektrum erweitern könnten. Durch das Verwenden einer Desoxyribonuklease oder die Durchführung einer Dichtegradientenzentrifugation könnten eventuell vorhandene Plasmide denaturiert bzw. von den anderen Bestandteilen der Enzymlösung getrennt und danach isoliert werden. Abschließend kann festgestellt werden, dass die Behandlung von Penicillin G-haltiger Milch mit den in den Enzymlösungen enthaltenen β-Laktamasen eine einfach anwendbare und effektive Abbaumethode darstellt, die dem Abbau von Penicillin G durch Ansäuern und Erhitzen der Milch insbesondere aufgrund geringerer energetischer Kosten vorzuziehen ist. Allerdings entstehen durch die Anschaffung eines solchen enzymatischen Produktes ebenfalls Kosten für den Landwirt, die aktuell noch nicht vorausgesagt werden können. Der größte Vorteil der enzymatischen Abbaumethode ist, dass lediglich eine Erhitzung der Milch auf 37 °C notwendig ist, die beispielsweise mit Hilfe eines Milchtaxis mit Pasteurisierungsfunktion realisiert werden kann, wobei ein integriertes Rührwerk vorhanden sein sollte, um die ständige Durchmischung von Milch und Enzymen zu gewährleisten. Nach der erforderlichen Inkubationszeit von 2 Stunden reicht das Pasteurisieren der Milch aus (z.B. bei 63 °C für 30 Minuten), um eine vollständige Denaturierung der Enzyme herbeizuführen. Danach kann die Milch unschädlich über die Gülle entsorgt oder an die Kälber verfüttert werden. Damit eine solche Methode in der Zukunft in größerem Umfang auf Milchviehbetrieben angewendet werden kann, bedarf es jedoch zunächst noch eines erheblichen Forschungsbedarfs sowie im Anschluss eines Herstellungsprozesses, der ein effektives und finanziell erschwingliches Produkt hervorbringt. Denkbar ist beispielsweise die Galenik in Tablettenform oder auch das Koppeln der Enzyme an Trägersubstanzen wie Eupergit C. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit ist es gelungen, eine Grundlage für weitere Untersuchungen zum Abbau von β-Laktamantibiotika in Milch zu schaffen und aufzuzeigen, dass der Einsatz von β-Laktamasen in Hemmstoffmilch auf Milchviehbetrieben eine große Chance bietet, den Eintrag von β-Laktamantibiotika in die Umwelt zukünftig zu reduzieren.

Mastitis treatment reclaims about 68 % of all the antibiotics used in the dairy sector. β-lactam antibiotics as penicillin or cephalosporin are widely used for local treatment of mastitis due to their high effectiveness and their currently unproblematic antimicrobial resistance situation (mastitis caused by S. aureus excluded). It has been established that during and after local treatment with Penicillin G almost 50 % of the applied antibiotic dose is excreted non-metabolized via the milk and that the antibiotic amount can reach 25 mg Penicillin G per kilogram milk after treatment of all quarters depending on the milking frequency. Milk obtained from cows receiving mastitis treatment is waste milk and must not enter the food chain within the withdrawal period. For this reason, maximum residue levels (MRL) for pharmacologically active drugs in animal tissues and their products (VO (EG) No. 470/2009) were determined by the European Union. The MRL for Penicillin G in milk amounts to 4 µg/kg. Waste milk is either disposed on agricultural areas with the liquid manure or it is fed to calves. Both procedures lead to severe ecological consequences. If manure containing waste milk is used as fertilizer, the antibiotic residues or their metabolites enter the soil where they can persist or reach the groundwater. Subsequently, they might reach the human food chain by plants cultivated on these areas. It has been reported that the use of manure containing waste milk affects the bacterial microbiome of the soil and that the transfer of resistance genes is favored by the presence of antibiotics over a long period and at subtherapeutic concentrations.The practice of feeding waste milk to calves is considered a potential risk factor for the selection of antimicrobial drug resistant bacteria. An increased proportion of resistant E. coli in feces from pre-weaned calves was found when they had been fed with waste milk compared to the feces of calves that had received bulk milk. Further negative effects on the calves’ health are still unknown. Since the development of resistant or even multi-resistant bacteria is growing, the intake of antibiotic residues in the environment should be minimized to reduce the promotion of antimicrobial resistance. For example, in veterinary medicine, the use of third and fourth generation cephalosporins was restricted by the change of the TÄHAV in May 2018. This will probably lead to an increased application of narrow-spectrum penicillin and requires a careful observation of their resistance situation. This study aims to develop an implementable approach for the degradation of Penicillin G in waste milk on dairy farms which works efficiently without posing a risk to the user or the environment. In order to succeed, the degradation of Penicillin G concentrations occurring in milk during and after local mastitis treatment is needed and the remaining antibiotic concentration in milk must fall short of the MRL. The first part of the study deals with the degradation of Penicillin G by physico-chemical treatments as exposure to heat, acid or hydrogen peroxide, while the second part is concerned with the enzymatic degradation with β-lactamases. Generally, β-lactam antibiotics are degraded by opening the β-lactam ring through hydrolysis. Since this ring is the active part of the drug and therefore responsible for the antibiotic activity, changes in its structure cause the loss of all antibiotic activity. Firstly, sole heat treatment of milk spiked with 4 µg/kg Penicillin G with temperatures up to 95 °C was performed. Only heating at 95 °C for 120 minutes has been successful and has led to a degradation of the antibiotic, but higher Penicillin G concentrations could not be degraded. This result shows that sole heat treatment is not sufficient to degrade Penicillin G in milk. Therefore, spiked milk was heated at temperatures from 75 °C to 90 °C for several periods of time after previous acidification with lactic acid at the pH-values 4.0, 4.5, 5.0 and 5.5. It has turned out that the degradation of Penicillin G in milk runs easier the higher the heating temperature, the less the pH-value and the longer the heating time is. Furthermore, it has been shown that degradation of antibiotic concentrations in the mg-range is only possible through heat treatment at 80 °C and 90 °C in combination with the pH-values 4.0 and 4.5. For instance, the degradation of 64 mg/kg Penicillin G in milk at pH-value 4.0 occurs after heat treatment at 80 °C for 90 minutes, while under the same conditions heating at 90 °C leads to the degradation of 100 mg/kg. However, the degradation of Penicillin G in milk at pH-value 4.5 requires the maximum temperature of 90 °C. Heating for 90 minutes degrades an antibiotic concentration of 64 mg/kg. Both pH-values allow the degradation of even higher concentrations by heat treatment at 90 °C for 120 minutes. The application on dairy farms requires a technical equipment for the heating process so that a temperature up to 90 °C can be performed. On the farms, heating is possible by means of pasteurizer for calf milk, but only a few of them can reach this temperature. The process of acidification and heating of milk with Penicillin G works easily and quickly, but the high heating temperature and the long heating period needs a high energy supply which is expensive. Therefore, it is highly unlikely that this procedure will meet with the approval of the farmers. Furthermore, calves may refuse to drink the acidified milk because the pH-value in soured milk for calves should not fall below 5.5. As a consequence, this milk can only be disposed with the manure. As third physico-chemical treatment, the application of hydrogen peroxide and subsequent heating was analyzed but this method has not caused any degradation of Penicillin G in milk. In the second part of this study, coliform bacteria isolated from mastitis milk samples of the University of Applied Sciences and Arts Hannover were screened for the production of ESBLs with the double disk approximation test by Jarlier et al. (1988). Eight of them have shown ESBL production and have been identified as strains of E. coli by MALDI-TOF. Then, it was tried to extract the enzymes of these strains during their cultivation at 37 °C in brain heart infusion by sterile filtration at different times. Although the addition of a low Penicillin G concentration to the brain heart infusion is assumed to stimulate the production of β-lactamases during the growth process, this could not be proved for 10 mg/kg Penicillin G. One reason might be that the antibiotic slows down the growth of the E. coli-strains, but this seems highly unlikely because the strains are ESBL producers showing resistance to Penicillin G. The missing stimulatory effect of Penicillin G on the enzymatic production requires further research and lower antibiotic concentrations could be applied for stimulation. The trials have shown that the filtrates obtained from the E. coli-strains in brain heart infusion contain a varying amount of β-lactamases depending on the collection time and that different incubation periods are needed to degrade 25 mg/kg Penicillin G in milk at 37 °C. Three of the eight enzyme solutions of E. coli-strains, namely from strain 7124, 13111 and 15072, have been capable to degrade the antibiotic concentration within 2 hours. The collection of their enzymatic solutions took place after 3.5 hours and at an optical density of 1.1 in the brain heart infusion (7124), after 4 hours and at an optical density of 1.13 (13111) as well as after 4.5 hours at an optical density of 1.24 (15072). The required amount of enzymatic solutions is 0.5 % in relation to the amount of milk. The fact that the enzymatic solutions could be extracted from the brain heart infusion by sterile filtration is surprising, given that according to the relevant literature β-lactamases of gram-negative bacteria are located in the periplasmatic space while gram-positive bacteria generally release their enzymes in the surroundings. In this case active enzymatic secretion is most likely. However, the β-lactamases could also originate from dead E. coli, but during exponential growth only a few bacteria die so that the enzymatic concentration would not be sufficient to degrade 25 mg/kg Penicillin G in milk within only 2 hours. Therefore, the mechanisms of enzymatic release should be subject of further studies. Subsequently, the three enzymatic solutions were analyzed regarding their preferred temperature and pH-value range and regarding their heat stability and storage conditions at -18 °C, at 8 °C and at room temperature. The highest enzymatic activity was determined for temperatures between 25 °C and 37 °C. Moreover, neutral and slightly acidic media conditions are preferred (max. pH-value 5.5). Enzymatic denaturation occurs throughout heating for 15 minutes at 60 °C (7124) or at 50 °C (13111, 15072). Storage is possible at -18 °C for at least 4 weeks without loss of enzymatic activity. Freezing and refreezing should not be performed more than three times. Storage at 8 °C is possible for a maximum of 4 weeks (7124, 13111, 15072), while storage at room temperature is possible for 3 (7124, 13111) and 4 (15072) weeks respectively. Furthermore, freeze-drying of the enzymatic solutions was performed to improve shelf life, but has led to a reduction in the enzymatic activity. Since freeze-drying is a very popular technique in the pharmaceutical industry, this process could be of great importance regarding a prospective productional process. Possibly, the use of cryoprotectives will lead to improvements. However, further studies on the process of freeze-drying should be performed. The application of the three enzymatic solutions in milk with Penicillin G is a promising approach but must also be performed with other β-lactam antibiotics, penicillins and cephalosporins at the same time. Furthermore, to assure environmental safety enzymatic solutions must not contain bacterial components as plasmids for example, which are very small (nm-range) and are able to pass the filters used in this work. Since bacteria are able to incorporate plasmids by transformation, the intake of plasmids in the environment may cause severe consequences regarding the development of resistance in other bacteria. This might be avoided by the application of a desoxyribonuclease that splits the plasmids or by the performance of a density gradient centrifugation in order to separate and isolate the plasmids from the rest of the enzymatic solution. Concluding it can be stated that the application of β-lactamases for the degradation of Penicillin G residues in milk is more convincing than the procedure of acidification and heating of milk. This is mainly due to the fact that a much lower heating temperature of milk is required which is more effective from an economic point of view. However, the costs of such an enzymatic product cannot be predicted yet. Heating of milk at 37 °C can be effectuated easily by a pasteurizer for calf milk with an integrated stirring unit. Afterwards, the milk should be pasteurized to guarantee the denaturation of the β-lactamases (e.g. at 63 °C for 30 minutes). After the treatment the milk can be disposed with the manure or fed to the calves. The application of this degradation method requires the production of enzymatic solutions in large-scale and the development of a product with a long shelf-life. To ensure a high adoption by the farmers the acquisition must be affordable. The preparation in form of tablets or the linking to carrier substances as Eupergit C is conceivable. The results of this study can be the starting point for further studies on the degradation of β-lactam antibiotics in milk, showing that the use of β-lactamases in waste milk on dairy farms is a great opportunity to reduce the intake of antibiotic residues in the environment.

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Renner, Romina: Abbau von β-Laktamantibiotika in Hemmstoffmilch. Hannover 2019. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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