Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Role of regulatory T cells, cytotoxic T cells and interleukin-10 in Theiler's murine encephalomyelitis virus infection

Ciurkiewicz, Małgorzata

Zahlreiche weit verbreitete Viren weisen ein neurovirulentes Potential auf und können strukturelle oder funktionelle Schädigungen des zentralen Nervensystems verursachen. Neben akuten und oft lebensbedrohlichen entzündlichen Erkrankungen können auch vorübergehende oder subklinische Infektionen tiefgreifende Langzeitfolgen für die neurologische Funktion haben. Zytopathische Effekte, die sich aus der Virusreplikation ergeben, können zum Tod infizierter Neuronen führen. Andererseits können Gewebeverletzungen jedoch auch durch eine übermäßige Immunantwort vermittelt werden. Langzeitkomplikationen von viralen Enzephalitiden umfassen Epilepsie sowie Beeinträchtigung der kognitiven Funktionen wie Lern- und Gedächtnisstörungen. Darüber hinaus können Virusinfektionen dazu führen, dass das Immunsystem Selbstantigene angreift und eine Autoimmunität verursacht. Das Theiler‘sche Murine Enzephalomyelitis Virus (TMEV) ist ein einzelsträngiges RNS-Virus der Picornaviridae-Familie, das experimentell für Modelle humaner Erkrankungen verwendet wird. Nach einer intrazerebralen Infektion befällt das Virus hauptsächlich Neuronen und zeigt einen besonderen Tropismus für limbische Strukturen einschließlich des Hippokampus. Die weiteren Folgen der Infektion hängen vom genetischen Hintergrund der verwendeten Mäuse ab. In SJL Mäusen persistiert das Virus lebenslang und löst eine chronisch-entzündliche demyelinisierende Erkrankung in der weißen Substanz von Rückenmark und Gehirn aus. Viele Aspekte der Pathogenese ähneln der progressiven Form der Multiplen Sklerose (MS) und machen die Theilervirus-Infektion zu einem wertvollen Modell für die menschliche Erkrankung. Im Gegensatz dazu sind Mäuse mit einem C57BL/6-Hintergrund in der Lage, das Virus mittels einer wirksamen antiviralen zytotoxischen T-Zellantwort innerhalb weniger Wochen zu eliminieren. Viele Tiere zeigen jedoch einen erheblichen Verlust von hippokampalen Neuronen, die mit akuten Krampfanfällen und kognitiver Beeinträchtigungen einhergehen. Außerdem entwickeln betroffene Mäuse häufig wiederkehrende, chronische Krampfanfälle. Daher hat die TMEV-Infektion auch als virales Modell für Epilepsie an Bedeutung gewonnen. Die Gründe für die unterschiedliche Anfälligkeit sind noch nicht vollständig bekannt. Im Frühstadium der Infektion weisen C57BL/6-Mäuse eine signifikant höhere Anzahl von ZNS-infiltrierenden CD8+ zytotoxischen T-Zellen im Vergleich zu SJL-Tieren auf. Im Gegensatz dazu wird in SJL-Mäusen eine initiale Expansion von regulatorischen T-Zellen (Treg) beobachtet, die mit einer erhöhten Produktion des entzündungshemmenden Zytokins Interleukin (IL)-10 einhergeht. Treg sind eine Untergruppe von CD4+ T-Zellen mit immunmodulierenden und tolerogenen Eigenschaften. IL-10 ist ein pleiotropes Zytokin, das hauptsächlich als negativer Regler von Entzündungsreaktionen angesehen wird. Treg und IL-10 tragen zur Aufrechterhaltung der Immunhomöostase bei und hemmen schädliche Entzündungsreaktionen. Im Zusammenhang mit viralen Infektionen kann diese Hemmung negative Auswirkungen auf die antivirale Immunität haben. Daher wurden erhöhte Treg-Zahlen und die verstärkte IL-10-Sekretion mit der TMEV-Persistenz von SJL-Mäusen in Verbindung gebracht. Im ersten Teil der Studie lag der Fokus auf den Wechselwirkungen von zytotoxischen T-Zellen und Treg in C57BL/6-Mäusen. Gruppen von TMEV- oder Mock-infizierten C57BL/6-Mäusen wurden entweder mit IL-2/-Anti-IL-2-Antikörper-Komplexen behandelt, um regulatorische T-Zellen zu expandieren (Treg-Expansion), oder bekamen Anti-CD8-Antikörper um zytotoxischen T-Zellen zu depletieren (CD8-Depletion). Eine dritte Gruppe erhielt eine Kombination aus Treg-Expansion und CD8-Depletion (kombinierte Behandlung). In Übereinstimmung mit früheren Studien hatte die alleinige Treg-Expansion, trotz einer verstärkten Infiltration von Foxp3+ Treg in das Gehirn, keinen Einfluss auf die Viruselimination und Demyelinisierung. Im Gegensatz dazu führte die kombinierte Behandlung zu einer verlängerten und verstärkten hippokampalen Infektion, die mit einer lokalen Hochregulierung von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen einherging. Darüber hinaus führte die Kombination von Treg-Expansion und CD8-Depletion zu einem Myelinverlust sowie Axonschäden im Rückenmark. Durchflusszytometrische und immunhistologische Analysen des systemischen T-Zell Gleichgewichts zeigten, dass die Treg-Expansion die Regeneration der CD8+ T-Zellpopulation erheblich verzögerte. Der Einfluss von IL-10 auf die antivirale Immunität und die hippokampale Protektion wurde im zweiten Teil der Studie untersucht. Zunächst wurde die Expressionskinetik von Genen, die an der IL-10-Signalgebung beteiligt sind, in TMEV infizierten SJL-Mäusen analysiert. Im Einklang mit früheren Ergebnissen wurde eine vorübergehende Hochregulierung von Il10-mRNS nachgewiesen. Darüber hinaus zeigten die Transkripte von Il10rα, Jak1, Socs3 und Stat3 eine ähnliche Hochregulierung, während bei der Expression von Il10rβ und Tyk2 keine Unterschiede festgestellt wurden. Anschließend wurden SJL-Mäusen blockierende Anti-IL-10-Rezeptor(IL-10R)-Antikörper injiziert und die Auswirkungen auf die hippokampale Viruslast, pathologischen Läsionen und Entzündung ausgewertet. Die IL-10R-Blockade löste einen ausgeprägten neuronalen Verlust im Hippokampus aus, der mit einer verstärkten Rekrutierung von CD3+ T-Zellen, CD45R+ B-Zellen und einer Hochregulierung von Il1α-mRNA einherging. Der Schweregrad der Neurodegeneration war vergleichbar mit den bei C57BL/6-Mäusen beobachteten Läsionen. Trotz der verstärkten Entzündungsreaktion konnte die IL-10R-Blockade die Viruselimination nicht beschleunigen. Parallel zu den proinflammatorischen Reaktionen zeigten IL-10R-blockierte Tiere eine erhöhte Anzahl von Foxp3+ Treg und Arginase-1+ Makrophagen/Mikroglia sowie eine erhöhte Expression von Tgfβ und Foxp3 im Hippocampus und Chi3l3 in der Milz. Die verstärkten immunmodulatorischen Reaktionen stellen einen potenziellen kompensatorischen Mechanismus dar, der darauf abzielt, den immunvermittelten Schaden in Abwesenheit eines IL-10-Signals zu begrenzen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass erhöhte Treg-Zahlen und eine verstärkte IL-10-Expression die Unterschiede in der Empfindlichkeit für TMEV-Persistenz nicht vollständig erklären können. Die immunsuppressive Wirkung von Treg hängt vom genetischen Hintergrund und der Intensität der zytotoxischer T-Zell-Antwort ab. In einem CD8-defizienten Wirt kann eine übermäßige Treg-Funktion tiefgreifende Auswirkungen auf die antivirale Immunität haben und zu einer Viruspersistenz führen. Während gezeigt wurde, dass eine Treg-Depletion die antivirale Immunität in SJL-Mäusen verstärkt, führte eine Blockade des IL-10 Rezeptors nicht zu einer verminderten Viruslast, was darauf hindeutet, dass andere Mechanismen an der Treg-vermittelten Suppression in diesem Mäusestamm beteiligt sind. Der ausgeprägte nachteilige Effekt der IL-10R Blockade auf die Integrität des Hippokampus zeigt, dass IL-10 im TMEV-Modell zur Neuroprotektion beiträgt. Die Ergebnisse beider Studien verdeutlichen potentielle Risiken und Nutzen einer therapeutischen Manipulation von Treg und IL-10.

Several widespread viruses have neurovirulent potential and may cause structural or functional damage in the central nervous system (CNS). Besides acute and potentially life-threatening inflammatory diseases, transient or subclinical infections can have profound long-term consequences for neurological function. Cytopathic effects resulting from viral replication can cause death of infected neurons, but tissue injury can also be mediated by an exuberant immune response. Long-term complications of viral encephalitis include epilepsy as well as changes in cognitive function, such as learning and memory deficits. Moreover, virus infections can trigger the immune system to attack self-antigens and cause autoimmunity. Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) is a single-stranded RNA virus belonging to the Picornaviridae family, which is used experimentally to model human diseases. Following intracerebral infection, the virus primarily targets neurons and shows a particular tropism to limbic structures including the hippocampus. The outcome of infection depends on the genetic background of the mice. In Swiss Jim Lambert (SJL) mice, the virus persists throughout the lifespan of the animals and triggers a chronic inflammatory demyelinating disease in the spinal cord and cerebral white matter. Many aspects of the pathogenesis resemble the situation observed in progressive forms of multiple sclerosis (MS) – making TMEV-infection a valuable model for the human disease. In contrast, mice with a C57BL/6 background are able to clear the virus within a few weeks by means of an efficient antiviral cytotoxic T cell response. However, many animals show a considerable loss of hippocampal neurons following acute infection, which is associated with acute seizures and cognitive impairment. In addition, affected mice frequently develop recurrent unprovoked seizures. Therefore, TMEV infection has recently gained importance as a viral model for epilepsy. The reasons for the differential susceptibility are not fully understood yet. C57BL/6 mice show significantly higher numbers of CNS–infiltrating CD8+ T cells compared to SJL animals in early infection. In contrast, an initial regulatory T cell (Treg)-expansion, associated with increased production of the anti-inflammatory cytokine interleukin (IL)-10 is observed in SJL mice. Treg are a subset of CD4+ T cells with immunomodulatory and tolerogenic functions. IL-10 is a pleiotropic cytokine which is considered the negative master regulator of inflammation. Treg and IL-10 contribute to maintenance of immune homeostasis and suppress excessive inflammatory responses. In the context of viral infections, this suppression can have detrimental effects on antiviral immunity. Therefore, elevated Treg numbers and IL-10 secretion have been implicated in TMEV persistence of SJL mice. The first part of the study focused on the interplay of cytotoxic T cells and Treg in C57BL/6 mice. Groups of TMEV- or mock-infected animals were treated with IL-2/-anti-IL-2-antibody-complexes (IL-2C) to expand Treg (Treg-expansion), or anti-CD8-antibodies (αCD8-Ab) to deplete cytotoxic T cells (CD8-depletion). A third group received a combination of Treg-expansion and CD8-depletion (combined treatment). In agreement with previous reports, Treg-expansion alone had no effect on virus clearance and susceptibility to demyelination, despite an increased infiltration of Foxp3+ Treg into the brain. In contrast, the combined treatment resulted in a prolonged and augmented hippocampal infection, which was associated with a local upregulation of pro- and anti-inflammatory cytokines. Moreover, the combination of Treg-expansion and CD8-depletion predisposed the animals to myelin loss and axonal damage in the spinal cord. Flow cytometric and immunohistochemical analysis of the systemic T cell balance revealed that Treg-expansion considerably delays regeneration of the CD8+ T cell population. The involvement of IL-10 in impaired antiviral immunity and hippocampal protection was investigated in the second part of the study. First, the expression kinetics of genes involved in IL-10 signaling were analyzed in TMEV-infected SJL mice. Confirming earlier results, a transient upregulation of Il10 mRNA was detected in early infection. Moreover, the transcripts of Il10rα, Jak1, Socs3, and Stat3 showed a similar upregulation, while no differences were detected in Il10rβ and Tyk2 expression. Subsequently, SJL mice were injected with blocking anti-IL-10 receptor (IL-10R) antibodies and the effects on hippocampal viral load, pathologic lesions and inflammation were evaluated. IL-10R blockade triggered a marked hippocampal neuronal loss accompanied by increased recruitment of CD3+ T cells, CD45R+ B cells and an upregulation of Il1α mRNA. The severity of neurodegeneration was comparable to that observed in C57BL/6 mice. Despite increased inflammation, IL-10R blockade failed to enhance virus clearance. In parallel to pro-inflammatory responses, IL-10R blocked animals showed elevated number of Foxp3+ Treg and arginase-1+ macrophages/microglia as well as increased expression of Tgfβ and Foxp3 in the hippocampus and Chi3l3 in the spleen. The enhanced immunomodulatory responses represent a potential compensatory mechanism aiming at limiting immune-mediated damage in the absence of IL-10 signaling. In conclusion, elevated Treg numbers and increased IL-10 expression cannot fully account for differences in susceptibility to TMEV persistence. The suppressive capacity of Treg is dependent on the genetic background and the strength of cytotoxic T cell responses. In a CD8-deficient host, excessive Treg function can have a profound negative effect on antiviral immunity and predispose the host to virus persistence. While Treg depletion has been shown to improve antiviral immunity in SJL mice, IL-10R blockade did not reduce viral load, which indicates that other mechanisms are involved in Treg-mediated suppression in this mouse strain. The marked effect on the hippocampal integrity resulting from IL-10R blockade shows that IL-10 is involved in neuroprotection in the TMEV model. Collectively, the results highlight potential risks and benefits of therapeutic strategies based on Treg- and IL-10-manipulation.

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Ciurkiewicz, Małgorzata: Role of regulatory T cells, cytotoxic T cells and interleukin-10 in Theiler's murine encephalomyelitis virus infection. Gießen 1. Auflage 2019 2019. DVG Service GmbH.

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