Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Die Eignung verschiedener Zelllinien aus Karpfen zur Replikation und Re-Isolation von karpfenpathogenen Viren

Felten, Martin

Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, neu entwickelte Zelllinien aus Karpfen auf ihre Eignung zur Replikation des Cypriniden Herpesvirus 3 (CyHV-3), dem Carp Edema Virus (CEV) und einem karpfenpathogenen Paramyxovirus und zur Re-Isolierung dieser Viren aus Geweben infizierter Fische näher zu untersuchen. Da nach wie vor der Bedarf nach einem geeigneten Vakzin gegen das CyHV-3 besteht, sollte geprüft werden, welche der Zelllinien sich am besten zur Replikation von CyHV-3 eignet, um über eine geeignete Zelllinie zur Herstellung von Antigen für das Vakzin zu verfügen. Zudem ist es bisher nicht gelungen CEV in vitro zu kultivieren, daher wurden im Rahmen dieser Arbeit neben den neu entwickelten Zelllinien auch bereits etablierte Zelllinien und Primärkulturen aus Kiemen von Karpfen auf ihre Eignung zur Replikation des CEV untersucht. Weiterhin sollten die Zelllinien hinsichtlich des Zelltyps charakterisiert und eine Veränderung der Zelldifferenzierung unter Infektion, die Interferon vermittelte Immunantwort der Zellen auf die Infektion und die diagnostische Eignung der Zelllinien zum Nachweis des CyHV-3 in Organ- und stimulierten Leukozytenproben untersucht werden. Dazu wurden von der Fraunhofer EMB die neu entwickelten Zelllinien ccAbre, ccAcar, ccAgill und ccApin bezogen und mit CyHV-3, CEV und dem Paramyxovirus infiziert. In allen Versuchen wurde die etablierte Zelllinie CCB als Referenz eingesetzt. Um zu prüfen, ob Unterschiede in der Empfänglichkeit von Zellen für Virusinfektion auf passagespezifischen Unterschieden beruhen könnten, wurden vier verschiedene Passagen der CCB-Zelllinie verwendet und die Eignung der verschiedenen Passagen zur Replikation der Viren mit den neu entwickelten Zelllinien verglichen. Es wurde von allen verwendeten Zelllinien 0, 2, 4 und 7 Tagen nach Infektion Virus aus dem Zellkultur-Überstand von jeweils drei Kulturen isoliert, wobei Tag 0 als Referenzwert für das eingesetzte Virus verwendet wurde. Nach 2, 4 und 7 Tagen Kultur wurden Zellen vom Boden der Kultur gewonnen und zelluläre sowie virale mRNA aus den Proben isoliert. Bei den Primärkulturen aus Karpfenkiemen und den Kulturen von CCG-Zellen stand der Nachweis viraler mRNA von CEV im Vordergrund, während bei Kulturen der KFC und ccApin-Zelllinien die Untersuchung der Transkription zellulärer mRNA zur vergleichenden Typisierung der neu entwickelten ccApin Zelllinie das Hauptziel darstellte. Die Analyse der Expression von Genen, die Cadherin 1, Cytokeratin 15 und Occludin kodieren, wurde im Rahmen der Zelltypisierung als Marker für epitheliale Zellen sowie das Gen, das Vimentin kodiert als Marker für Fibroblasten verwendet. Die Transkripton dieser Gene und die Bestimmung der Virusgehalte wurden mit Hilfe der RT-qPCR durchgeführt. Die Analyse der Immunantwort anhand der Expression des Interferon a2-Gens erfolgte ebenfalls mittels RT-qPCR. Bei der Untersuchung der Zelllinien zur diagnostischen Eignung wurde der Virusgehalt des CyHV-3 in den mitogenstimulierten Leukozyten von latent infizierten Karpfen und in Gewebeproben aus akut an CyHV-3 erkrankten Tieren zunächst ebenfalls mit qPCR bestimmt. Die Auswertung von Zellveränderungen in der Kultur erfolgte anhand der Überprüfung auf die Entstehung eines zytopathischen Effektes. Es zeigte sich, dass sich die ccAbre-Zelllinie am besten zur Replikation des CyHV-3 eignet und die CCB-Zellen der Passage 146 die höchsten Gehalte viraler mRNA des karpfenpathogenen Paramyxovirus aufwiesen. Die höchste Empfänglichkeit für das karpfenpathogene Paramyxovirus zeigte die ccAbre-Zelllinie, aber sie replizierte das Virus schlechter als die CCB-146-Zelllinie. Darüber hinaus zeigte sich, dass die Replikationsraten für das CyHV-3 und das Paramyxovirus in der CCB-Zelllinie in erheblichem Maße von der verwendeten Passage abhängig waren, mit hohen Replikationsraten in Zellen der Passage 146 für das Paramyxovirus und Passage 70 bzw. 335 für das CyHV-3 und geringer Replikation in Zellen der Passage 146 für das CyHV-3 bzw. Passage 335 für das Paramyxovirus. Keine der verwendeten Zelllinien oder Primärkulturen war geeignet, das CEV in vitro zuverlässig zu replizieren. Die Zelltypisierung ergab, dass es sich bei allen neu entwickelten Zelllinien um Mischkulturen aus Epithel- und Mesenchymzellen handelte, wobei sich während einer Beobachtung über 7 Tage keine Veränderung des Zelltyps unter Infektion mit CyHV-3 und dem Paramyxovirus zeigte. Zudem ergaben die Untersuchungen, dass Zellen der CCB-Passage 146 keine epithelialen Marker exprimierten, während Zellen der CCB Passagen 70 und 335 neben Vimentin auch Cadherin 1, Cytokeratin 15 und Occludin exprimierten. Bei den Primärkulturen aus Karpfenkiemen handelte es sich dagegen um Epithelzellkulturen. Die Untersuchung der Immunantwort ergab, dass das Paramyxovirus eine deutliche Interferon a2-vermittelte Immunantwort in allen Zelllinien außer ccAgill-Zellen provozierte und dass CyHV-3 zu einer deutlich schwächeren Interferonantwort führte oder sogar die Interferonantwort herabregulierte. Abschließend zeigte sich, dass sich die Zelllinien nicht zur Diagnostik für CyHV-3 aus mitogenstimulierten Leukozyten latent infizierter Fische oder zum Nachweis von CyHV-3 aus Gewebeproben akut erkrankter Fische eignete. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen einen deutlichen Zusammenhang zwischen Zelltyp, dem Ausgangsgewebe, aus dem die Zelllinie angezüchtet wurde, der Passage der verwendeten Zelllinie und ihrer Immunantwort auf die Infektion und der Eignung der Zelllinie für die Replikation- und Reisolierung der Viren CyHV-3, CEV und des Paramyxovirus.

The aim of this work was to analyze newly developed carp cell lines for their suitability for replication of Cyprinid Herpesvirus 3 (CyHV-3), Carp Edema Virus (CEV) and a carp pathogenic Paramyxovirus and for re-isolation of these viruses from tissues of infected fish. Since there is still a need for a suitable vaccine against CyHV-3, it should be examined which of the cell lines is best suited for replication of CyHV-3 in order to have a suitable cell line for the production of antigen for the vaccine. In addition, CEV has not yet been cultivated in vitro. Therefore, in addition to the newly developed cell lines, established cell lines and primary cultures from carp gills have also been investigated for their suitability for CEV replication. Furthermore, the cell lines should be characterized with regard to cell type and a change in cell differentiation under infection, the Interferon mediated immune response of the cells to infection and the diagnostic suitability of the cell lines for the detection of CyHV-3 in organ and stimulated leukocyte samples should be investigated. The Fraunhofer EMB prepared the newly developed cell lines ccAbre, ccAcar, ccAgill and ccApin and in this study, these cell lines were infected with CyHV-3, CEV and the Paramyxovirus. In all experiments, the established cell line CCB was used as a reference. To test whether differences in the susceptibility of cells to virus infection might be due to passage-specific differences, 4 different passages of the CCB cell line were used and the suitability of the different passages for replication of viruses was compared with the newly developed cell lines. From all cell lines used 0, 2, 4 and 7 days after infection with virus the cell culture supernatant was collected from 3 cultures each. Using day 0 as the reference value changes of the amount of virus in the culture supernatant during cultivations was determined. After 2, 4 and 7 days of culture, cells were collected from the bottom of the culture and cellular and viral mRNA were isolated from the samples. For primary cultures from carp gills and from CCG cell cultures the detection of viral mRNA from CEV was in the foreground, whereas for the cultures of KFC and ccApin cell lines the investigation of transcription of cellular mRNA for comparative typing of the newly developed ccApin cell line was the main objective. The analysis of the expression of genes coding for Cadherin 1, Cytokeratin 15 and Occludin was used as markers for epithelial cells and the gene coding for Vimentin as marker for Fibroblasts. The transcription of these genes and the determination of virus levels were performed using RT-qPCR. The analysis of the immune response by expression analysis of the Interferon a2 gene was also performed by RT-qPCR. When examining the cell lines for diagnostic suitability, the virus content of the CyHV-3 in the mitogen-stimulated leukocytes of latently infected carp and in tissue samples from fish acutely infected with CyHV-3 was initially also determined with qPCR. The evaluation of cell changes in the culture was based on the examination of the development of a cytopathic effect. It was shown that the ccAbre cell line is best suited for replication of CyHV-3 and that the CCB cells of passage 146 had the highest viral mRNA levels of the Paramyxovirus. The ccAbre cell line showed the highest susceptibility to the Paramyxovirus, but it replicated the virus worse than the CCB-146 cell line. In addition, replication rates for CyHV-3 and Paramyxovirus in the CCB cell line were significantly dependent on the used passage, with high replication rates in cells of passage 146 for Paramyxovirus and passage 70 and 335 for CyHV-3, respectively, and low replication in cells of passage 146 for CyHV-3 and passage 335 for Paramyxovirus. None of the cell lines or primary cultures were suitable for reliably replicating the CEV in vitro. The cell typing showed that all newly developed cell lines were mixed cultures of epithelial and mesenchymal cells. During an observation over 7 days no change of the cell type was observed under infection with CyHV-3 and the Paramyxovirus. In addition, the investigations showed that cells of CCB passage 146 did not express epithelial markers, while cells of CCB passages 70 and 335 also expressed Cadherin 1, Cytokeratin 15 and Occludin in addition to Vimentin. The primary cultures from carp gills were epithelial cell cultures. The investigation of the immune response showed that the Paramyxovirus provoked a distinct Interferon a2 mediated immune response in all cell lines except ccAgill cells and that CyHV-3 led to a significantly weaker Interferon response or even down-regulated the interferon response. Finally, it was found that the cell lines were not suitable for the diagnosis of CyHV-3 from mitogen-stimulated leukocytes of latently infected fish or for the detection of CyHV-3 from tissue samples of acutely diseased fish. The results of this work show a clear correlation between cell type, the starting tissue from which the cell line was cultured, the passage number of the cell line used and its immune response to infection, and the suitability of the cell line for replication and re-isolation of the viruses CyHV-3, CEV and the Paramyxovirus.

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Felten, Martin: Die Eignung verschiedener Zelllinien aus Karpfen zur Replikation und Re-Isolation von karpfenpathogenen Viren. Hannover 2019. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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