Die Eignung verschiedener Zelllinien aus Karpfen zur Replikation und Re-Isolation von karpfenpathogenen Viren

Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, neu entwickelte Zelllinien aus Karpfen auf ihre Eignung zur Replikation des Cypriniden Herpesvirus 3 (CyHV-3), dem Carp Edema Virus (CEV) und einem karpfenpathogenen Paramyxovirus und zur Re-Isolierung dieser Viren aus Geweben infizierter Fische näher zu untersuchen. Da nach wie vor der Bedarf nach einem geeigneten Vakzin gegen das CyHV-3 besteht, sollte geprüft werden, welche der Zelllinien sich am besten zur Replikation von CyHV-3 eignet, um über eine geeignete Zelllinie zur Herstellung von Antigen für das Vakzin zu verfügen. Zudem ist es bisher nicht gelungen CEV in vitro zu kultivieren, daher wurden im Rahmen dieser Arbeit neben den neu entwickelten Zelllinien auch bereits etablierte Zelllinien und Primärkulturen aus Kiemen von Karpfen auf ihre Eignung zur Replikation des CEV untersucht. Weiterhin sollten die Zelllinien hinsichtlich des Zelltyps charakterisiert und eine Veränderung der Zelldifferenzierung unter Infektion, die Interferon vermittelte Immunantwort der Zellen auf die Infektion und die diagnostische Eignung der Zelllinien zum Nachweis des CyHV-3 in Organ- und stimulierten Leukozytenproben untersucht werden. Dazu wurden von der Fraunhofer EMB die neu entwickelten Zelllinien ccAbre, ccAcar, ccAgill und ccApin bezogen und mit CyHV-3, CEV und dem Paramyxovirus infiziert. In allen Versuchen wurde die etablierte Zelllinie CCB als Referenz eingesetzt. Um zu prüfen, ob Unterschiede in der Empfänglichkeit von Zellen für Virusinfektion auf passagespezifischen Unterschieden beruhen könnten, wurden vier verschiedene Passagen der CCB-Zelllinie verwendet und die Eignung der verschiedenen Passagen zur Replikation der Viren mit den neu entwickelten Zelllinien verglichen. Es wurde von allen verwendeten Zelllinien 0, 2, 4 und 7 Tagen nach Infektion Virus aus dem Zellkultur-Überstand von jeweils drei Kulturen isoliert, wobei Tag 0 als Referenzwert für das eingesetzte Virus verwendet wurde. Nach 2, 4 und 7 Tagen Kultur wurden Zellen vom Boden der Kultur gewonnen und zelluläre sowie virale mRNA aus den Proben isoliert. Bei den Primärkulturen aus Karpfenkiemen und den Kulturen von CCG-Zellen stand der Nachweis viraler mRNA von CEV im Vordergrund, während bei Kulturen der KFC und ccApin-Zelllinien die Untersuchung der Transkription zellulärer mRNA zur vergleichenden Typisierung der neu entwickelten ccApin Zelllinie das Hauptziel darstellte. Die Analyse der Expression von Genen, die Cadherin 1, Cytokeratin 15 und Occludin kodieren, wurde im Rahmen der Zelltypisierung als Marker für epitheliale Zellen sowie das Gen, das Vimentin kodiert als Marker für Fibroblasten verwendet. Die Transkripton dieser Gene und die Bestimmung der Virusgehalte wurden mit Hilfe der RT-qPCR durchgeführt. Die Analyse der Immunantwort anhand der Expression des Interferon a2-Gens erfolgte ebenfalls mittels RT-qPCR. Bei der Untersuchung der Zelllinien zur diagnostischen Eignung wurde der Virusgehalt des CyHV-3 in den mitogenstimulierten Leukozyten von latent infizierten Karpfen und in Gewebeproben aus akut an CyHV-3 erkrankten Tieren zunächst ebenfalls mit qPCR bestimmt. Die Auswertung von Zellveränderungen in der Kultur erfolgte anhand der Überprüfung auf die Entstehung eines zytopathischen Effektes. Es zeigte sich, dass sich die ccAbre-Zelllinie am besten zur Replikation des CyHV-3 eignet und die CCB-Zellen der Passage 146 die höchsten Gehalte viraler mRNA des karpfenpathogenen Paramyxovirus aufwiesen. Die höchste Empfänglichkeit für das karpfenpathogene Paramyxovirus zeigte die ccAbre-Zelllinie, aber sie replizierte das Virus schlechter als die CCB-146-Zelllinie. Darüber hinaus zeigte sich, dass die Replikationsraten für das CyHV-3 und das Paramyxovirus in der CCB-Zelllinie in erheblichem Maße von der verwendeten Passage abhängig waren, mit hohen Replikationsraten in Zellen der Passage 146 für das Paramyxovirus und Passage 70 bzw. 335 für das CyHV-3 und geringer Replikation in Zellen der Passage 146 für das CyHV-3 bzw. Passage 335 für das Paramyxovirus. Keine der verwendeten Zelllinien oder Primärkulturen war geeignet, das CEV in vitro zuverlässig zu replizieren. Die Zelltypisierung ergab, dass es sich bei allen neu entwickelten Zelllinien um Mischkulturen aus Epithel- und Mesenchymzellen handelte, wobei sich während einer Beobachtung über 7 Tage keine Veränderung des Zelltyps unter Infektion mit CyHV-3 und dem Paramyxovirus zeigte. Zudem ergaben die Untersuchungen, dass Zellen der CCB-Passage 146 keine epithelialen Marker exprimierten, während Zellen der CCB Passagen 70 und 335 neben Vimentin auch Cadherin 1, Cytokeratin 15 und Occludin exprimierten. Bei den Primärkulturen aus Karpfenkiemen handelte es sich dagegen um Epithelzellkulturen. Die Untersuchung der Immunantwort ergab, dass das Paramyxovirus eine deutliche Interferon a2-vermittelte Immunantwort in allen Zelllinien außer ccAgill-Zellen provozierte und dass CyHV-3 zu einer deutlich schwächeren Interferonantwort führte oder sogar die Interferonantwort herabregulierte. Abschließend zeigte sich, dass sich die Zelllinien nicht zur Diagnostik für CyHV-3 aus mitogenstimulierten Leukozyten latent infizierter Fische oder zum Nachweis von CyHV-3 aus Gewebeproben akut erkrankter Fische eignete. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen einen deutlichen Zusammenhang zwischen Zelltyp, dem Ausgangsgewebe, aus dem die Zelllinie angezüchtet wurde, der Passage der verwendeten Zelllinie und ihrer Immunantwort auf die Infektion und der Eignung der Zelllinie für die Replikation- und Reisolierung der Viren CyHV-3, CEV und des Paramyxovirus.