Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Role of C-type lectin receptors in bacterial recognition

Mayer-Lambertz, Sabine

Eine der wichtigsten Aufgabe des angeborenen Immunsystems ist die Erkennung von Erregern, die in den Wirt eindringen und ihn schädigen. Um diese körperfremden Strukturen zu detektieren, tragen die Immunzellen des Wirtes sogenannte Mustererkennungsrezeptoren (engl.: „Pattern-recognition receptors“, PRRs) auf ihrer Oberfläche, die konservierte Pathogen-assoziierte molekulare Muster (engl.: „Pathogen-associated molecular patterns“, PAMPs) in allen Klassen von Erregern wie Bakterien, Viren, Parasiten und Pilzen erkennen. PRRs umfassen lösliche und membrangebundene Rezeptoren sowie intrazelluläre Rezeptoren wie nucelotide-binding oligomerization domain-like Rezeptoren, retinoic acid inducible gene I Rezeptoren und Toll-like Rezeptoren. Zusätzlich zählen zu den PRRs auch die extrazellulär lokalisierten C-Typ Lektin Rezeptoren (CLRs). Ursprünglich wurden CLRs als kalziumabhängige Kohlenhydrat-bindende Proteine beschrieben. Dieser Kenntnisstand änderte sich jedoch mit der Entdeckung, dass CLRs auch Lipide, Proteine, Kristalle und anorganische Moleküle erkennen und dass diese Bindung nicht unbedingt durch Kalzium vermittelt werden muss. Macrophage-inducible C-type lectin (Mincle) ist ein Typ II Transmembranprotein, welches von Makrophagen, Dendritischen Zellen, Neutrophilen und Monozyten exprimiert wird. Die Aktivierung von Mincle durch die Bindung von Liganden an die Kohlenhydrat-erkennende Domäne (engl.: „Carbohydrate-recognition domain“, CRD) führt zur Phosphorylierung der „Spleen-tyrosine kinase“ (Syk), die die Bildung des CARD9/Bcl10/Malt1 Komplexes und die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκ-B initiiert. Letztlich werden NFκ-B-vermittelte Effektorfunktionen wie die Produktion von Zytokinen und Chemokinen, Phagozytose und Degranulation ausgelöst. Bakterien besitzen eine Vielzahl von Kohlenhydratstrukturen (Glykane) auf ihrer Oberfläche. Diese Strukturen spielen eine wichtige Rolle in der Adhäsion und dem Eindringen in die Wirtszelle sowie bei der Immunevasion. Da diese Strukturen essentiell für eine erfolgreiche bakterielle Besiedlung und Pathogenese im Wirt sind, stellt die Entdeckung neuer CLR/Bakterien-Interaktionen einen wichtigen ersten Ansatzpunkt dar, um eine bakterielle Infektion zu verhindern. Das Kapitel 3 beschäftigt sich mit drei unterschiedlichen Methoden, um bislang unbekannte CLR/Bakterien-Interaktionen aufzudecken. Dabei werden die Methoden anhand des humanpathogenen Bakteriums Campylobacter jejuni beschrieben. Allerdings können die Methoden auf weitere Gram-negative sowie Gram-positive Bakterienstämme ausgedehnt werden. Alle Techniken basieren auf einer CLR-hFc Fusionsprotein-Bibliothek. Die CLR-hFc Fusionsproteine bestehen aus dem Fc-Teil eines humanen IgG1, das mit der CRD des entsprechenden Rezeptors fusioniert wurde. Ein ELISA-basierter Hochdurchsatz-Assay wird als erstes durchgeführt, der initiale Ergebnisse zu möglichen CLR/Bakterien-Interaktionen liefert. Diese Methode basiert auf der Immobilisierung der Bakterien, die anschließend mit den CLR-hFc Fusionsproteinen inkubiert werden. Die Umsetzung des Substrats ABTS durch einen sekundären anti-human IgG1-Fc Antikörper, konjugiert an das Enzym Meerrettichperoxidase, ermöglicht die Detektion von CLR/Bakterien-Interaktionen. Auf diese Weise wurde Dectin-1 als Rezeptor für die C. jejuni Isolate MHH19 und MHH24 entdeckt. Da diese Methode durch die Bildung von Proteinaggregaten die Möglichkeit von falsch-positiven Ergebnissen birgt, wurde ein nachfolgender durchflusszytometrischer Ansatz zur Verifizierung der Kandidaten durchgeführt. Dabei wurden die Bakterien in Lösung mit den Fusionsproteinen und einem sekundären anti-human IgG1 Fc Antikörper inkubiert, bevor die Proben durchflusszytometrisch analysiert wurden. Hierbei konnte die Bindung von Dectin-1-hFc an beide C. jejuni-Isolate bestätigt werden. Zum Schluss wurde die Dectin-1-hFc/C. jejuni-Interaktion durch Konfokalmikroskopie visualisiert. Zusammenfassend ermöglichen die drei auf CLR-Fusionsproteinen basierenden Methoden das Screening von einer Vielzahl an Bakterienstämmen auf neue CLR-Interaktionen. Dies ist ein erster Schritt, der zur Identifikation eines distinkten CLR-Liganden und zum besseren Verständnis von dessen biologischer Funktion führt. Das Kapitel 4 dieser These beschreibt die Identifikation von Strukturen des Lipoteichonsäureankers (LTA) in Gruppe A Streptokokken (GAS) als Mincle-Liganden, die in der Lage sind, eine Immunantwort gegen GAS auszulösen. Genexpressionsstudien und Zellstimulationsexperimente zeigten, dass CARD9, ein Adaptermolekül von Mincle, an der Immunantwort gegen GAS beteiligt ist. Die Stimulation von Makrophagen, die aus dem Knochenmark differenziert wurden, mit aufgereinigtem Monoglucosyldiacylglycerol (MGDG) aus dem LTA führte zu einer Mincle-abhängigen Produktion von proinflammatorischen Zytokinen, reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und der Aktivierung der Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS). Zusätzlich wurde gezeigt, dass von dem LTA aufgereinigtes Diglucosyldiacylglycerol (DGDG) von Mincle erkannt wird, jedoch zu keiner Signalweiterleitung innerhalb der Zelle führt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass DGDG Mincle inhibiert, während MGDG als Mincle-Agonist fungiert. Die Infektion von Mäusen mit einigen GAS-Stämmen zeigte, dass Mincle-Defizienz zu einer gesteigerten Anfälligkeit auf Grund von erhöhter Bakterienlast und Expression von proinflammatorischen Zytokinen führte. Alles in allem zeigen diese Ergebnisse, dass Mincle eine schützende Rolle in der Immunabwehr gegen GAS besitzt. Zusammenfassend präsentiert diese Arbeit umfangreiche Methoden, um neue Interaktionen von CLRs und Bakterien zu detektieren. Außerdem trägt diese Arbeit zu der Entdeckung bei, dass die beiden LTA Bestandteile MGDG und DGDG aus GAS als neue Mincle Liganden fungieren.

The most important function of the innate immune system is the recognition of pathogens that may cause damage to the host. To sense foreign structures, host immune cells express so-called pattern-recognition receptors (PRRs) on their surface to detect highly conserved pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) present in all classes of pathogens like bacteria, viruses, parasites, and fungi. PRRs comprise soluble and transmembrane receptors, including intracellular receptors as nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors, retinoic acid inducible gene I receptors and Toll-like receptors, but also the extracellularly located C-type lectin receptors (CLRs). CLRs were originally described as calcium-dependent carbohydrate-binding proteins. Nowadays, it is known that CLRs additionally detect other ligands than carbohydrates such as lipids, proteins, ice crystals and inorganic molecules. Furthermore, also calcium-independent ligand binding of CLRs has been described. Macrophage-inducible C-type lectin (Mincle) is a type II transmembrane protein expressed by monocytes, neutrophils, macrophages and dendritic cells. Activation of Mincle by ligand recognition leads to phosphorylation of spleen-tyrosine kinase that in turn induces the formation of the ternary CARD9/Bcl10/Malt1 complex and the activation of the transcription factor NFκ-B. Finally, NFκ-B triggers effector functions such as the production of cyto- and chemokines, cell degranulation and phagocytosis. Bacteria are known to express various carbohydrate structures (glycans) on their surface that play important roles in host cell adhesion, invasion and immune evasion. Since these structures are crucial for bacterial colonization, survival, growth and initiation of pathogenesis, there is rising interest in detecting novel CLR/bacteria interactions to prevent infections. Chapter 3 of this thesis deals with the detailed description of three different methodologies to detect yet unknown CLR/bacteria interactions using the very frequent human pathogen Campylobacter jejuni as model organism. All methods presented can be easily applied to other Gram-negative and Gram-positive bacteria and build on a comprehensive CLR-hFc fusion protein library. CLR-hFc fusion proteins consist of the Fc part of a human IgG1 fused to the carbohydrate-recognition domain (CRD) of the respective CLR. First, an ELISA-based high-throughput assay is described that allows for an initial pre-screening for CLR/bacteria interactions. This method relies on plate-coated bacteria that are incubated with the respective fusion proteins. Finally, binding is detected by reaction of the colorimetric substrate ABTS with a secondary anti-human IgG1 Fc antibody coupled to horseradish peroxidase. Among others, Dectin-1-hFc was found to bind to C. jejuni isolates MHH19 and MHH24. Since false-positive CLR candidates may occur due to protein aggregation, a following flow cytometry-based assay was established to confirm potential binding partners. Here, bacteria were kept in solution, incubated with the CLR-hFc fusion proteins and binding was detected by the usage of an anti-human IgG1-Fc antibody in a subsequent flow cytometric analysis. Applying this protocol, binding to Dectin-1-hFc was confirmed for both C. jejuni isolates. Finally, a confocal microscopy approach is presented that enables direct visualization of the CLR binding to bacteria. Also, in this assay, Dectin-1-hFc was found to recognise both C. jejuni isolates. In summary, the described methods based on CLR-hFc fusion proteins offer the possibility to screen for various novel CLR/bacteria interactions. The detection of these candidates presents the first step towards bacterial ligand identification and the analysis of the biological function of the respective CLRs. The identification of Mincle as CLR that recognises parts of the lipoteichoic acid anchor (LTA) present in the cell wall of the human pathogen group A Streptococcus (GAS) and thereby promoting antibacterial immunity is part of chapter 4. Gene expression analysis and cell stimulation assays revealed that the Mincle adaptor protein CARD9 is involved in the immune responses against GAS infection. Stimulation of bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) with purified monoglucosyldiacylglycerol (MGDG) of LTA led to a Mincle-dependent production of inflammatory cytokines, reactive oxygen species (ROS) and the activation of inducible nitric oxide synthase (iNOS). In addition, the purified diglucosyldiacylglycerol (DGDG) of the LTA is recognised by Mincle but does not initiate signaling. Furthermore, it was found that DGDG serves as suppressor of Mincle whereas MGDG mediates agonistic Mincle activation. In vivo, Mincle-deficient mice infected with GAS strains others than the 5448 exhibited high mortality in line with severe bacteraemia and an increased expression of proinflammatory cytokines. In summary, these results suggest a protective role for Mincle in anti-GAS immunity. This work presents comprehensive methods to detect novel CLR/bacteria interactions and contributed to the identification of GAS-derived MGDG and DGDG as new Mincle ligands.

Quote

Citation style:

Mayer-Lambertz, Sabine: Role of C-type lectin receptors in bacterial recognition. Hannover 2019. Tierärztliche Hochschule Hannover.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export