Role of C-type lectin receptors in bacterial recognition

Eine der wichtigsten Aufgabe des angeborenen Immunsystems ist die Erkennung von Erregern, die in den Wirt eindringen und ihn schädigen. Um diese körperfremden Strukturen zu detektieren, tragen die Immunzellen des Wirtes sogenannte Mustererkennungsrezeptoren (engl.: „Pattern-recognition receptors“, PRRs) auf ihrer Oberfläche, die konservierte Pathogen-assoziierte molekulare Muster (engl.: „Pathogen-associated molecular patterns“, PAMPs) in allen Klassen von Erregern wie Bakterien, Viren, Parasiten und Pilzen erkennen. PRRs umfassen lösliche und membrangebundene Rezeptoren sowie intrazelluläre Rezeptoren wie nucelotide-binding oligomerization domain-like Rezeptoren, retinoic acid inducible gene I Rezeptoren und Toll-like Rezeptoren. Zusätzlich zählen zu den PRRs auch die extrazellulär lokalisierten C-Typ Lektin Rezeptoren (CLRs). Ursprünglich wurden CLRs als kalziumabhängige Kohlenhydrat-bindende Proteine beschrieben. Dieser Kenntnisstand änderte sich jedoch mit der Entdeckung, dass CLRs auch Lipide, Proteine, Kristalle und anorganische Moleküle erkennen und dass diese Bindung nicht unbedingt durch Kalzium vermittelt werden muss. Macrophage-inducible C-type lectin (Mincle) ist ein Typ II Transmembranprotein, welches von Makrophagen, Dendritischen Zellen, Neutrophilen und Monozyten exprimiert wird. Die Aktivierung von Mincle durch die Bindung von Liganden an die Kohlenhydrat-erkennende Domäne (engl.: „Carbohydrate-recognition domain“, CRD) führt zur Phosphorylierung der „Spleen-tyrosine kinase“ (Syk), die die Bildung des CARD9/Bcl10/Malt1 Komplexes und die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκ-B initiiert. Letztlich werden NFκ-B-vermittelte Effektorfunktionen wie die Produktion von Zytokinen und Chemokinen, Phagozytose und Degranulation ausgelöst. Bakterien besitzen eine Vielzahl von Kohlenhydratstrukturen (Glykane) auf ihrer Oberfläche. Diese Strukturen spielen eine wichtige Rolle in der Adhäsion und dem Eindringen in die Wirtszelle sowie bei der Immunevasion. Da diese Strukturen essentiell für eine erfolgreiche bakterielle Besiedlung und Pathogenese im Wirt sind, stellt die Entdeckung neuer CLR/Bakterien-Interaktionen einen wichtigen ersten Ansatzpunkt dar, um eine bakterielle Infektion zu verhindern. Das Kapitel 3 beschäftigt sich mit drei unterschiedlichen Methoden, um bislang unbekannte CLR/Bakterien-Interaktionen aufzudecken. Dabei werden die Methoden anhand des humanpathogenen Bakteriums Campylobacter jejuni beschrieben. Allerdings können die Methoden auf weitere Gram-negative sowie Gram-positive Bakterienstämme ausgedehnt werden. Alle Techniken basieren auf einer CLR-hFc Fusionsprotein-Bibliothek. Die CLR-hFc Fusionsproteine bestehen aus dem Fc-Teil eines humanen IgG1, das mit der CRD des entsprechenden Rezeptors fusioniert wurde. Ein ELISA-basierter Hochdurchsatz-Assay wird als erstes durchgeführt, der initiale Ergebnisse zu möglichen CLR/Bakterien-Interaktionen liefert. Diese Methode basiert auf der Immobilisierung der Bakterien, die anschließend mit den CLR-hFc Fusionsproteinen inkubiert werden. Die Umsetzung des Substrats ABTS durch einen sekundären anti-human IgG1-Fc Antikörper, konjugiert an das Enzym Meerrettichperoxidase, ermöglicht die Detektion von CLR/Bakterien-Interaktionen. Auf diese Weise wurde Dectin-1 als Rezeptor für die C. jejuni Isolate MHH19 und MHH24 entdeckt. Da diese Methode durch die Bildung von Proteinaggregaten die Möglichkeit von falsch-positiven Ergebnissen birgt, wurde ein nachfolgender durchflusszytometrischer Ansatz zur Verifizierung der Kandidaten durchgeführt. Dabei wurden die Bakterien in Lösung mit den Fusionsproteinen und einem sekundären anti-human IgG1 Fc Antikörper inkubiert, bevor die Proben durchflusszytometrisch analysiert wurden. Hierbei konnte die Bindung von Dectin-1-hFc an beide C. jejuni-Isolate bestätigt werden. Zum Schluss wurde die Dectin-1-hFc/C. jejuni-Interaktion durch Konfokalmikroskopie visualisiert. Zusammenfassend ermöglichen die drei auf CLR-Fusionsproteinen basierenden Methoden das Screening von einer Vielzahl an Bakterienstämmen auf neue CLR-Interaktionen. Dies ist ein erster Schritt, der zur Identifikation eines distinkten CLR-Liganden und zum besseren Verständnis von dessen biologischer Funktion führt. Das Kapitel 4 dieser These beschreibt die Identifikation von Strukturen des Lipoteichonsäureankers (LTA) in Gruppe A Streptokokken (GAS) als Mincle-Liganden, die in der Lage sind, eine Immunantwort gegen GAS auszulösen. Genexpressionsstudien und Zellstimulationsexperimente zeigten, dass CARD9, ein Adaptermolekül von Mincle, an der Immunantwort gegen GAS beteiligt ist. Die Stimulation von Makrophagen, die aus dem Knochenmark differenziert wurden, mit aufgereinigtem Monoglucosyldiacylglycerol (MGDG) aus dem LTA führte zu einer Mincle-abhängigen Produktion von proinflammatorischen Zytokinen, reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und der Aktivierung der Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS). Zusätzlich wurde gezeigt, dass von dem LTA aufgereinigtes Diglucosyldiacylglycerol (DGDG) von Mincle erkannt wird, jedoch zu keiner Signalweiterleitung innerhalb der Zelle führt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass DGDG Mincle inhibiert, während MGDG als Mincle-Agonist fungiert. Die Infektion von Mäusen mit einigen GAS-Stämmen zeigte, dass Mincle-Defizienz zu einer gesteigerten Anfälligkeit auf Grund von erhöhter Bakterienlast und Expression von proinflammatorischen Zytokinen führte. Alles in allem zeigen diese Ergebnisse, dass Mincle eine schützende Rolle in der Immunabwehr gegen GAS besitzt. Zusammenfassend präsentiert diese Arbeit umfangreiche Methoden, um neue Interaktionen von CLRs und Bakterien zu detektieren. Außerdem trägt diese Arbeit zu der Entdeckung bei, dass die beiden LTA Bestandteile MGDG und DGDG aus GAS als neue Mincle Liganden fungieren.