Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

A C-type lectin receptor (CLR)-Fc fusion protein library as a toolbox to detect novel CLR ligands and the interplay of CLR/virus interactions

Monteiro, João Gonçalo Tereno

Glycosylation is a highly diverse process that produces an abundant repertoire of glycan structures, which can be found conjugated to other biomolecules, such as proteins and lipids. Myeloid C-type lectin receptors (CLRs) in innate immunity represent a family of pattern recognition receptors that are specialized in the recognition of glycan structures present at the surface of pathogens and host cells. Upon recognition, myeloid CLRs expressed by antigen presenting cells, like dendritic cells (DCs) and macrophages, impact phagocytosis, cytokine secretion and antigen processing and presentation to T cells. Therefore, CLRs represent an interesting target for the development of immunotherapies due to their crucial role in initiation of innate responses and ability to shape adaptive immunity. In the first part of this thesis, an extension of a CLR-hFc fusion protein library and identification of novel CLR ligands were performed. Addition of five novel CLR members was accomplished, namely four murine CLRs, SIGNR5-hFc, CLEC13A-hFc, CLEC5A-hFc, Langerin-hFc and one human CLR, L-SIGN-hFc. The extended CLR-hFc library containing about 20 immunologically relevant CLRs represents a valuable screening platform for the identification of novel CLR ligands and to investigate pathogen/CLR interactions. The CLR-hFc library was used to probe different glycan libraries immobilized on microarray slides for high-throughput identification of novel CLR ligands. Herein, it was also observed that the position of glycan moieties and multivalent presentation of glycans impacted CLR recognition. The second part focused on the identification of highly specific glycan structures to target the macrophage galactose-type lectin (MGL), since this myeloid CLR is involved in the recognition of tumor antigens present on altered host cells and in antitumor immune responses. Tumor antigens can be found attached to different glycoproteins, namely mucin-1 (MUC1), which is considered one of the most important targets for the development of antitumor strategies. By probing a MUC1-like glycopeptide microarray platform, where tumor antigens were placed at different positions of the peptide backbone, with three MGL orthologs, a highly specific MGL divalent glycopeptide binder was discovered. In addition, by fluorescently labelling this glycopeptide, MGL-dependent uptake in DCs could be observed. Therefore, the findings reported may represent a building block for the rational design of antitumor vaccines that target DCs via MGL. In the last part, extension of the applications of the CLR-hFc fusion protein library was envisioned, namely by developing a method to detect CLR interactions with enveloped viruses. CLR/viruses interactions display an intrinsic duality, since CLRs can either act as viral entry receptors and be subverted to ensure viral replication and dissemination, or CLRs are either involved in antiviral responses. To investigate CLR/viruses interactions, La Crosse virus (LACV), a neuroinvasive virus particularly affecting children under 16 years of age, was used as an example. A flow-through chromatography process was established to obtain highly pure LACV, which was used to interrogate in an ELISA-based assay the extended CLR-hFc fusion protein library. The macrophage inducible Ca2+-dependent lectin receptor (Mincle), a caspase recruitment domain-containing protein 9 (CARD9)-associated CLR, was found to recognize LACV. Mincle-/- and CARD9-/- DCs challenged with LACV displayed an impaired pro-inflammatory cytokine production, albeit no differences in LACV titer when compared to WT DCs. Therefore, the Mincle/CARD9 axis seems to play a limited role in innate responses against LACV.

Durch den Prozess der Glykosylierung wird eine Vielzahl an unterschiedlichen und komplexen Glykanstrukturen gebildet, die an andere Biomoleküle wie Proteine oder Fette konjugiert werden können. Myeloische C-Typ-Lektin-Rezeptoren (CLRs) präsentieren eine Gruppe der pattern-recognition-Rezeptoren, welche diese Glykanstrukturen auf der Oberfläche von Erregern oder der Wirtszellen erkennen können. Myeloische CLRs, die von antigenpräsentierenden Zellen wie dendritischen Zellen und Makrophagen exprimiert werden, modulieren nach ihrer Aktivierung Effektorfunktionen wie Phagozytose, Zytokinsekretion, Antigenprozessierung und Antigenpräsentation gegenüber T‑Zellen. Aufgrund ihrer Rolle in der Initiierung der angeborenen Immunantwort, als auch ihre Eigenschaft die erworbene Immunantwort modulieren zu können, eignen sich CLRs als ein vielversprechendes Target/Objekt für die Entwicklung von Immuntherapien. In dem ersten Teil der Doktorarbeit wurde die CLR-hFc-Fusionsprotein Bibliothek erweitert und neue CLR-Liganden konnten identifiziert werden. Fünf neue Vertreter der CLR-Familie wurden hinzugefügt; davon die vier murinen CLRs SIGNR5-hFc, CLEC13A-hFc, CLEC5A-hFc, Langerin-hFc sowie L-SIGN-hFc als humaner CLR. Die erweiterte CLR-hFc-Fusionsprotein Bibliothek umfasst derzeit 20 immunologisch relevante CLRs und repräsentiert damit eine wertvolle Screening-Plattform für die Identifikation von neuen CLR Liganden und Erreger/Rezeptor Interaktionen. Die CLR-hFc-Fusionsprotein Bibliothek wurde genutzt um verschiedene auf Mikroarray-Objektträgern immobilisierte Glykanbibliotheken mit hohem Durchsatz auf neue CLR Liganden zu testen. Hierbei wurde deutlich, dass die Position der Glykangruppen und deren multivalente Darstellung die Erkennung durch CLRs beeinflusste. Der zweite Teil befasste sich mit der Identifizierung von hochspezifischen Glykanstrukturen zur gezielten Aktivierung des macrophage galactose-type lectin (MGL). Dieser myeloische CLR ist an der Erkennung von Tumorantigenen auf veränderten Wirtszellen sowie an der Immunantwort gegen Tumore beteiligt und seine gezielte Aktivierung bietet einen attraktiven Therapieansatz. Tumorantigene können an verschiedene Glykoproteine gebunden sein. Ein solches Glykoprotein ist mucin-1 (MUC1), welches einer der wichtigsten Targets in der Entwicklung von Antitumorstrategien darstellt. Mittels einer MUC1-ähnlichen Glykopeptid- Mikroarray-Plattform, bei der Tumorantigene an verschiedenen Positionen des Peptidrückgrats platziert wurden, wurde durch Beprobung mit drei verschiedenen MGL Orthologen ein hochspezifischer bivalenter Glykopeptid Ligand entdeckt. Weiterhin konnte durch Fluoreszenzmarkierung dieses Glykopeptides eine MGL-abhängige Aufnahme in dendritische Zellen beobachtet werden. Die gezeigten Ergebnisse stellen einen Baustein für das rationale Design von Antitumor-Impfstoffen dar, die gezielt auf dendritische Zellen via MGL wirken können. In dem abschließenden Teil der Arbeit wurde eine Ausweitung der Anwendungsmöglichkeiten der CLR-hFc-Fusionsprotein Bibliothek angestrebt. Hierbei wurde eine Methode zur Identifizierung möglicher Interaktionen von CLR mit behüllten Viren entwickelt. CLR/Virus Interaktionen können vorteilhaft für den Virus sein, indem CLRs als Rezeptor genutzt werden und so Viruseintritt und Ausbreitung ermöglichen. Andererseits können CLR/Virus Interaktionen aber auch zur Induktion einer Immunantwort führen und somit zur Bekämpfung des Virus beitragen. Um mögliche CLR/Virus Interaktionen zu untersuchen, wurde das La Crosse Virus (LACV) genutzt. LACV ist ein neuroinvasives Virus, das hauptsächlich bei Kindern und Jugendliche zu schweren Infektionen führt. Um LACV in einem ELISA-basiertem Verfahren auf mögliche Interaktionen mit der erweiterten CLR-hFc-Fusionsprotein Bibliothek zu testen, musste zunächst ein Durchflusschromatographieverfahren etabliert werden, um eine hochreine Viruspräparation zu erhalten. Der macrophage inducible Ca2+-dependent lectin receptor (Mincle) ist ein caspase recruitment domain-containing protein 9 (CARD9) assoziierter CLR und in dem ELISA-basiertem Verfahren konnte eine Bindung von Mincle an LACV gezeigt werden. Mincle und CARD9 defiziente dendritische Zellen zeigten eine reduzierte pro-inflammatorische Zytokinproduktion nach LACV Infektion verglichen zu WT Zellen, wenn auch kein Unterschied in der Viruslast festzustellen war. Daraus lässt sich schließen, dass die Mincle/CARD9 Signalkaskade nur eine eingeschränkte Rolle in der Immunantwort gegenüber LACV spielt.

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Monteiro, João: A C-type lectin receptor (CLR)-Fc fusion protein library as a toolbox to detect novel CLR ligands and the interplay of CLR/virus interactions. Hannover 2019. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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