Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

In vitro-Untersuchungen zum Einsatz von Grassilagen mit unterschiedlichen Reineiweißgehalten : Einflüsse einer Sojaeiweißzulage oder einer Pepsinbehandlung auf das Vorkommen diphenolischer Verbindungen im Pansensaft

Friehold, Kathrin

Hintergrund der vorliegenden Arbeit ist die Beobachtung, dass die Verwendung von Grassilagen, deren Reineiweißanteil vom Rohprotein weniger als 50 % beträgt, zu vielfältigen, unspezifischen Krankheitssymptomen im Milchviehbestand führen kann. Besteht das Krankheitsgeschehen noch nicht zu lange, kann mit einer Ergänzung der Ration in Form von Sojaextraktionsschrot eine Genesung der Herde erzielt werden. In vorangegangenen Untersuchungen aus der gleichen Arbeitsgruppe taten sich die diphenolischen Substanzen als mögliche Einflussgrößen auf das Auftreten der „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ hervor. Das Ziel dieser Arbeit war, diphenolische Substanzen anhand ihres Masse-zu-Ladungsverhältnisses und ihrer Retentionszeit mittels LC-MS/MS zu identifizieren und zu quantifizieren. Ebenso erfolgte eine photometrische Analyse des o-Diphenolgehalts. Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf dem Einfluss sowohl von Sojaeiweiß als auch Pepsin. Untersucht wurden dazu zurückgestellte Proben des hiesigen RUSITEC-Systems. Die Versuchsdurchgänge (sog. Läufe, jeweils 28 Tage: Einlauf- und Kontrollphase bis Tag 8, Zulagephase von Tag 9-19, Erholungsphase von Tag 20-28) sind fortlaufend nummeriert. Proben der Überstandsflüssigkeit („Labmagenbedingungen“) aus acht Läufen, wobei jeweils vier Läufe eine identische Beladung des Systems mit Futtermitteln aufwiesen, wurden untersucht. Dabei wurde jede Probe zweifach aufgearbeitet, es erfolgte je eine Messung nach Zusatz von Pepsinlösung und eine der unbehandelten Probe. Während der Fermentation im RUSITEC-System wurde jeweils die gleiche Kontrollsilage (>50 % RE/Rp, 3. Schnitt des Jahres 2014) eingesetzt. Bei der in den Läufen 35-38 verwendeten Schadsilage (<50 % RE/Rp) handelte es sich um den 1. Schnitt des Jahres 2014. Bei der in den Läufen 39-42 verwendeten Schadsilage wurde der 1. Schnitt aus dem Jahre 2015 eingesetzt. Alle drei Silageproben stammten von denselben Flächen eines Betriebes. Fermenter 1+2 des RUSITEC-Systems waren während der Zulagephase mit Kontrollsilage und Stärke beladen worden, in den Testfermentern 3+4 befanden sich Schadsilage und Stärke und schließlich in den Testfermentern 5+6 Schadsilage, Stärke und Sojaprotein. Bei den LC-MS/MS-Analysen ergab sich ein erhöhter Gehalt von Phenylessigsäure (m/z 91) von durchschnittlich ca. +450 % in den Schadsilageüberständen im Vergleich zu den Kontrollüberständen. Der Gehalt von 2-Phenylethylamin (m/z 103, 105) war in den Schadsilageüberständen ebenfalls gegenüber den Kontrollüberständen um ca. +45 % erhöht. Auch Kaffeesäure (m/z 181) zeigte in den Überständen der Fermenter, die mit Schadsilage beladen worden waren, einen erhöhten Gehalt gegenüber dem Überstand des Kontrollfermenters von +67 % bis +131 %. Zusätzlich wurden Substanzen nachgewiesen, die in den Überständen von Kontroll- und Schadsilagefermentern in ungefähr gleicher Konzentration, aber wie die o.g. Stoffe auch mit einer zeitlichen Dynamik, vorlagen. Eine dieser Substanzen konnte als 3-Phenylpropionsäure identifiziert werden. Sie wies einen Gehalt zwischen 18-165 µg/ml in den Überstandsproben auf, welcher sich auch in der Literatur wiederfindet. Der erwartete Einfluss des Pepsins auf den Gehalt der nachgewiesenen Substanzen konnte nicht bestätigt werden. Aus diesen Ergebnissen lässt sich folgern, dass der Verdau von Schadsilage deutliche Auswirkungen auf die Bildung oder Anreicherung bestimmter Substanzen im RUSITEC hat. Pepsin und Soja scheinen darauf nur einen geringen Einfluss zu nehmen. Inwieweit diese Erkenntnisse in Zusammenhang mit der Entstehung des Krankheitsgeschehens der „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ stehen, muss zukünftig untersucht werden. Dazu ist die Identifikation der noch unbekannten m/z in den Überstandsproben mittels einer leistungsstärkeren LC-MC/MS-Anlage und geeigneter Standards erforderlich. Zusätzlich sollte eine quantitative Analyse derselben Substanzen in frisch geschnittenen Pflanzen, sowie vor und nach der Einsilierung erfolgen, um mehr Informationen zu in der Pflanze ablaufenden (patho)physiologischen Prozessen zu erhalten. Nur so können die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse letztlich eingeordnet und bewertet sowie die Ätiologie der „Faktorenerkrankung Milchviehherde“ geklärt werden.

According to EICKEN (2005a) the feeding of grass silage with a percentage of less than 50 % true protein to crude protein (TP/CP) leads to different unspecific disease symptoms in cattle. If the disease has not been in place for too long, reconvalescence can be achieved by feeding soybean meal to affected herds (EICKEN 2005b). Previous research of the same working group revealed that diphenolic substances might have an influence on the outbreak of the socalled “factorial disease in dairy herds”. It was the aim of this work to identify and quantify certain diphenolic substances by their mass-to-charge ratio (m/z) and their retention time by LC-MS/MS. A special attention was paid to the influence of soybean meal and pepsin on the results. For this purpose, reference samples of the local RUSITEC-system were analyzed. The individual runs (28 days each: Initial and stable phase until day 8, trial phase from day 9-19 and the final phase from day 20-28) were numbered consecutively. Samples from the supernatant (conditions similar to the abomasum) from eight runs were analyzed. Four runs each were fitted with the same silage. Every sample was prepared with or without the addition of pepsin. During the fermentation in the RUSITEC-system, identical control silage had been used (>50 % TP/CP, third cut of the year 2014). In the first group, suspected silage from the first cut of the year 2014 was used while in the second group the first cut of the year 2015 was used. All three silage samples were from the same land. During the trial phase, fermenters 1+2 of the RUSITEC-system were fed with control silage and starch, fermenters 3+4 were fitted with suspicious silage and starch and finally fermenters 5+6 contained suspected silage, starch and soybean protein. The LC-MS/MS measurements revealed a higher content (+450 %) of phenylacetic acid (m/z 91) in the supernatants from suspicious silage compared with those from control silage. The content of 2-phenylethylamine (m/z 103, 105) was also higher in the supernatants from suspicious silage (+45 %). Caffeic acid (m/z 181) showed higher contents in the supernatant from suspicious silage (+67 % to +131 %) as well. Furthermore, some substances with a similar content in all supernatant specimen were found. One of them was identified as 3-phenylpropionic acid with a concentration in the range of 18-165 µg/ml, which is also congruent to scientific literature. These m/z and the ones mentioned above showed a remarkable dynamic which was dependent on the timeline. The expected influence of pepsin on the content of the analyzed substances could not be confirmed. In conclusion, the digestion of suspicious silage affected the content of certain substances markedly, while the influence of pepsin and soybean protein seemed to be insignificant. Further experiments need to be done to find out, whether these findings are transferable on the “factorial disease in dairy herds”. It is important to identify the substances, which are unknown yet, by a more specific LC-MS/MS and appropriate standards. Furthermore, the content of these substances in recently cut grass, before and after ensilaging should be analyzed. This would be prerequisite to get more information on the pathophysiological processes in the plant and integrate the results of this work in the context of the possible aetiology of the “factorial disease in dairy herds”.

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Friehold, Kathrin: In vitro-Untersuchungen zum Einsatz von Grassilagen mit unterschiedlichen Reineiweißgehalten. Einflüsse einer Sojaeiweißzulage oder einer Pepsinbehandlung auf das Vorkommen diphenolischer Verbindungen im Pansensaft. Hannover 2019. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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