Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

The interaction of porcine respiratory pathogens with airway epithelial cells of pigs

Meng, Fandan

Die Atemwegserkrankung des Schweins ist die häufigste Krankheit in Schweinepopulationen und führt zu enormen wirtschaftlichen Verlusten in der Schweineindustrie auf der ganzen Welt. Die Wechselwirkungen dieser Atemwegserreger mit end-differenzierten Atemwegsepithelzellen und deren Wechselwirkungen untereinander in der Pathogenese von Co-Infektionen sind nur wenig verstanden. Hier wurden zwei Kultursysteme für end-differenzierte respiratorische Epithelzellen, Präzisionslungenschnitte von Schweinen (PCLS) und Air-liquid-interface (ALI)-Kulturen zur Untersuchung von Mono-Infektion durch Schweineinfluenzaviren (SIV) und von Co-Infektionen der Atemwege durch SIV und Streptococcus suis (S. suis) eingesetzt. In dieser Studie wurden die folgenden Aspekte behandelt: (i) die Rolle der Zilienaktivität bei der Prävention von SIV-Infektionen, (ii) die durch Krankheitserreger verursachte Schädigung der Epitheloberfläche, (iii) die schädliche Wirkung der beeinträchtigten mukoziliären Clearance und (iv) die Wirkung der SIV-Infektion auf die Invasion durch nicht-toxische S. suis- Mutanten. Zuerst analysierten wir mit PCLS vom Schwein die Wirkung der Zilienaktivität auf die Infektion der respiratorischen Epithelzellen durch SIV. Da Natriumchlorid (NaCl) bekanntlich eine ziliostatische Wirkung auf die Zilienbewegung hat, wurden PCLS zu verschiedenen Zeiten mit unterschiedlichen Konzentrationen von Natriumchlorid (NaCl) behandelt, um geeignete Bedingungen zu finden, die zu einer reversiblen Ziliostase führen. Ich fand heraus, dass die Behandlung mit 2% NaCl für 30 Minuten bei Raumtemperatur eine reversible Ziliostase induzierte. Wenn PCLS unter den ziliostatischen Bedingungen mit dem H3N2-Subtyp von SIV infiziert wurden, war der resultierende Virus-Titer im Überstand 24 oder 48 h nach der Infektion etwa zwei- bis dreifach höher als bei Schnitten mit normaler Zilienaktivität. Daher kommen wir zu dem Schluss, dass die Zilienbewegung nicht nur für den Transport des Schleims aus den Atemwegen verantwortlich ist, sondern auch eine Rolle bei der Verhinderung von Virusinfektionen spielt. Zweitens sind sowohl S. suis als auch SIV wichtige zoonotische Atemwegserreger, die ein Risiko für die globale öffentliche Gesundheit darstellen. Die Vorinfektion durch Influenza-A-Viren kann die Anfälligkeit des Wirtes für sekundäre bakterielle Infektionen fördern und zu schwereren Krankheiten und erhöhter Mortalität führen. Die molekularen Mechanismen von Co-Infektionen sind noch nicht vollständig verstanden. In einer früheren Studie habe ich festgestellt, dass Suilysin, ein porenbildendes cholesterinabhängiges Cytolysin, eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von S. suis spielt, indem es Apoptose im Atemwegepithel induziert. Einige der suilysin-negativen Stämme von S. suis können jedoch auch für ihren Wirt pathogen sein. Wir haben das ALI-Kultursystem des Schweins angewendet, um die Wirkung der SIV-Vorinfektion auf die Kolonisation und Invasion end-differenzierter Epithelzellen durch suilysin-defiziente Mutanten von S. suis zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass Suilysin zur Zytotoxizität bei end-differenzierten respiratorischen Epithelzellen im frühen Stadium der Co-Infektion beiträgt, während SIV in einem späteren Stadium zytotoxische Effekte zeigt. Darüber hinaus verbesserte eine vorherige Infektion mit SIV die Anheftung und Besiedlung von porzinen Atemwegsepithelzellen sowohl durch den Wildtyp-Stamm (wt) als auch durch eine suilysin-negative Mutante (10-sly) von S. suis; dieser Effekt war sialinsäureabhängig. Ein markanter Unterschied wurde beim Prozess der bakteriellen Invasion beobachtet. Während die wt-Streptokokken auch während der bakteriellen Monoinfektion eine Invasion zeigten, wurde die Invasion durch die suilysin-negative Mutante nur in ALI-Kulturen nachgewiesen, die mit SIV vorinfiziert waren. Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass die Co-Infektion mit SIV es suilysin-negativen S. suis-Stämmen ermöglicht, invasiv zu werden. Unsere Ergebnisse helfen zu erklären, warum suilysin-negative Stämme von erkrankten Schweinen isoliert werden können und liefern neue Erkenntnisse über die Virulenz von Streptokokken.

Porcine respiratory disease is the most common disease in pig populations resulting in huge economic losses in the porcine industry all over the world. Porcine respiratory disease can be caused by different infectious agents. The interactions of these respiratory pathogens with well-differentiated airway epithelial cells and their interactions among each other in the pathogenesis of co-infections are only poorly understood. Here, two well-differentiated respiratory epithelial cell culture systems, porcine precision-cut lung slices (PCLS) and porcine airway air-liquid interface (ALI) cultures were applied to investigate the mono-infection by swine influenza virus (SIV) and the co-infection of the respiratory tract by SIV and Streptococcus suis (S. suis). In this study, the following aspects have been addressed; (i) the role of the ciliary activity in preventing SIV infections, (ii) the pathogen-induced damage of the epithelial surface, (iii) the detrimental effect of the impaired mucociliary clearance and (iv) the effect of SIV infection on the invasion of epithelia by non-toxic S. suis. First we used porcine PCLS to analyse the effect of the ciliary activity on the infection of respiratory epithelial cells by SIV. As sodium chloride (NaCl) is known to have a ciliostatic effect on the cilia movement, PCLS were treated with different concentrations of NaCl for different times in order to find appropriate conditions that result in reversible ciliostasis. We found that the treatment with 2% NaCl for 30 min at room temperature induced a reversible ciliostasis. When PCLS were infected with the H3N2 subtype of SIV under ciliostatic conditions, the resulting virus titer in the supernatant was about two or three-fold higher at 24 or 48 h post-infection compared to slices with normal ciliary activity. Therefore, we conclude that the cilia beating is not only responsible for transporting the mucus out of the airways, but also plays a role in impeding virus infection. Second, both S. suis and SIV are important zoonotic respiratory pathogens that pose a risk to global public health. Pre-infection by influenza A viruses may promote the susceptibility of the host to secondary bacterial infection resulting in more severe disease and increased mortality. The molecular mechanisms of co-infections are incompletely understood. In a previous study, we have identified that suilysin, a pore-forming cholesterol-dependent cytolysin, plays an important role in the pathogenesis of S. suis by inducing apoptosis in the airway epithelium. However, some of suilysin-negative strains of S. suis may also be pathogenic for their host. We applied the porcine ALI culture system to investigate the effect of SIV pre-infection on the colonization and invasion of well-differentiated epithelial cells by suilysin-deficient mutants of S. suis. The results indicate that suilysin contributes to the cytotoxicity on well-differentiated respiratory epithelial cells in the early stage of co-infection, while SIV showed cytotoxic effects at a later stage. Furthermore, prior infection by SIV enhanced the adherence to and colonization of porcine airway epithelial cells by both the wild type strain (wt) and a suilysin-negative mutant (10-sly) of S. suis; this effect was sialic-acid dependent. A striking difference was observed in the bacterial invasion process. Whereas the wt streptococci showed invasion also during bacterial mono-infection, invasion by the suilysin-negative mutant was detected only in ALI cultures pre-infected by SIV. From these results we conclude that co-infection with SIV enables suilysin-negative S. suis strains to become invasive. These findings help to explain why suilysin-negative strains are isolated diseased pigs and provide new insights into the virulence of streptococci.

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Meng, Fandan: The interaction of porcine respiratory pathogens with airway epithelial cells of pigs. Hannover 2019. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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