Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Effects of dietary nitrogen and / or calcium on renal calcium and phosphate transport and modulation of calcitriol- and IGF1-synthesis in young goats

Firmenich, Caroline Susanne

Im Rahmen intensiver Nutztierhaltung tragen Wiederkäuer große Mengen Stickstoff (N) in Form von Ammoniak in die Umwelt ein. Eine diätetische Protein- und damit N-Versorgung nah am Bedarf der Tiere, ist ein Ansatz, der ökonomische sowie ökologische Ziele verfolgt. Der Wiederkäuer kann aufgrund der Wiederverwertung durch den ruminohepatischen Kreislauf Harnstoff effektiv als endogene N-Quelle nutzen. Ruminale Mikroorganismen synthetisieren mikrobielles Protein, welches die Hauptproteinquelle für Wiederkäuer darstellt, und können dafür Nicht-Protein-N (NPN)-Quellen wie Harnstoff nutzen. Im Fall einer verminderten N-Aufnahme über das Futter wird weniger Harnstoff renal ausgeschieden und gelangt stattdessen über die Speicheldrüsen in die Blutbahn und durch das Pansenepithel zurück in den Pansen. In vorangegangenen Studien führte eine verminderte N-Aufnahme zu einer reduzierten intestinalen Ca-Absorption und infolgedessen zu erniedrigten Blutkonzentrationen von Ca. Ursächlich für eine verminderte intestinale Ca-Aufnahme sind verringerte Expressionen der Ca-transportierenden Proteine infolge reduzierter Konzentrationen von 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 (Calcitriol), da die intestinalen Ca‑transportierenden Proteine in ihrer Expression durch Calcitriol moduliert werden. Der Grund für eine Reduzierung der Calcitriol-Spiegel könnte eine Minderung der Konzentrationen des Insulinähnlichen Wachstumsfaktors 1 (IGF1) sein, da IGF1 eine stimulierende Wirkung auf die renale Calcitriolsynthese hat. IGF1 wird vornehmlich in der Leber synthetisiert infolge pulsatiler Stimulation durch das Wachstumshormon (GH), welches aus dem Hypophysenvorderlappen ausgeschüttet wird. Das GH bindet an zwei GH‑Rezeptoren (GHR) und initiiert auf diese Weise eine intrazelluläre Signalkaskade, die Januskinase-Signal-transducers-and-Activators-of-Transkription (JAK‑STAT)-Kaskade, welche die IGF1-Synthese einleitet. Der JAK-STAT-Signalweg wird über einen negativen Feedback‑Mechanismus durch Supressor-of-cytokine-signalling (SOCS)-Proteine gehemmt. Es wird vermutet, dass IGF1 die Verbindung zwischen einer N-reduzierten Fütterung und erniedrigten Calcitriolspiegeln darstellt. Im ersten Teil des PhD-Projektes wurde der Effekt einer N- und / oder Ca-reduzierten Fütterung auf renale Ca- und Phosphat (Pi)-transportierende Proteine untersucht. Es wurde gezeigt, dass es durch eine N-reduzierte Fütterung zu einer Modulation der Expression renaler Ca-transportierender Proteine kommt, welche zu erniedrigten Ca-Spiegeln beitragen. Im Gegensatz dazu, führt eine Ca-reduzierte Fütterung nicht zu einer Modulation der untersuchten Proteine. Es kommt durch eine diätetische Ca-Reduktion zu einer kompensatorischen Erhöhung der Calcitriolsynthese. Die Proteinexpression des renalen Ca‑Transporters Transient-receptor-potential-cation-channel-subfamily-V-member-5 war infolge der N-reduzierten Fütterung erniedrigt, wohingegen es zu keiner Modulation der Expression durch die Ca-reduzierte Diät kam. Die mRNA- und Proteinexpressionen des Calcium-binding-proteins-D28K (CaBPD28K) und des Natrium-Ca-Austauschers (NCX1) waren bei den Tieren erniedrigt, die eine Fütterung mit erniedrigten N-Gehalten erhalten haben. Im Gegensatz dazu, kam es während einer Ca-reduzierten Fütterung zu einer Zunahme der mRNA‑Expression des CaBPD28K und des NCX1. Die mRNA- und Proteinexpression des Parathyroidhormonrezeptors war infolge der N-reduzierten Diät verringert. Die Expression des renalen Na-abhängigen Pi-Transporters IIa war durch das N-reduzierte Futter erhöht und ging mit konstanten Pi Konzentrationen einher. Eine kombinierte N- und Ca‑reduzierte Diät führte sogar zu einer Erhöhung der Pi-Gehalte im Plasma. Im zweiten Teil dieses Projektes wurde der Einfluss einer proteinarmen Fütterung auf den Vitamin-D- und Cholesterinstoffwechsel sowie die somatotrope Achse in Hinblick auf eine mögliche Modulation durch eine proteinreduzierte Fütterung untersucht. Es wurde zunächst gezeigt, dass hepatische Enzyme des Vitamin‑D- und Cholesterinstoffwechsels durch eine proteinreduzierte Fütterung in ihrer Expression moduliert werden. Da IGF1 eine stimulierende Wirkung auf die Calcitriolsynthese hat, wurde angenommen, dass der Einfluss einer proteinreduzierten Fütterung auf die GH-IGF1-Achse ursächlich für verringerte Ca‑Spiegel ist. Neben einer Messung der GH-Konzentrationen über einen Zeitraum von 24 Stunden wurden Komponenten, die an der Signalvermittlung der somatotropen Achse beteiligt sind, untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass es durch eine proteinreduzierte Fütterung nicht zu einer Veränderung der GH-Ausschüttung über 24 Stunden kommt, allerdings zu einer Minderung der Expression des hepatischen GHR. Zudem waren die Konzentrationen von Ca, Calcitriol und Insulin erniedrigt. Die mRNA-Expression von JAK2 und STAT5B, sowie die Proteinexpression von JAK2 und STAT1 wurden nicht beeinflusst infolge dieser Diät. Die Proteinexpression von STAT3 und STAT5B war durch die proteinreduzierte Fütterung tendenziell erhöht. Die Expression von SOCS1 wurde durch die proteinreduzierte Fütterung nicht beeinflusst, während die Expression von SOCS2 und SOCS3 erhöht war. Die Ergebnisse dieses Projektes lassen den Schluss zu, dass es durch eine proteinreduzierte Fütterung wachsender Ziegen, vermittelt durch eine Modulation der Expression des hepatischen GHR, zu einer Entkopplung der somatotropen Achse kommt. Ursächlich für eine erniedrigte Expression des GHR können erniedrigte Insulinkonzentrationen sein, welche infolge der proteinreduzierten Fütterung auftraten, da Insulin eine Rolle in der Expression des GHR spielt. Die Insulinsekretion ist unter anderem abhängig von Ca, so dass vermutet wird, dass die verringerten Konzentrationen von Ca ursächlich für erniedrigte Insulinwerte sind. Die Ergebnisse dieser PhD-Arbeit stellen die Grenzen der Anpassungsfähigkeit wachsender Ziegen an erniedrigte Proteingehalte dar. In weiterführenden Untersuchungen sollte eine mögliche Beeinflussung regulatorischer Mechanismen der GH‑Sekretion durch eine proteinreduzierte Fütterung untersucht werden, da reduzierte IGF1‑Konzentrationen über einen Feedback-Mechanismus einen Einfluss auf die GH-Ausschüttung haben könnten. Es gilt festzustellen, ob es zu einer Erniedrigung des gesamten IGF1 kommt oder ob die Gehalte an freiem IGF1 möglicherweise unbeeinflusst bleiben. Zudem sollte der Einfluss erniedrigter Insulinwerte und eine Modulation der Calcitriolsynthese durch andere Regulationswege einbezogen werden.

In intensive farming, ruminants contribute to huge amounts of nitrogen (N) excreted into the environment through urinary and faecal N output. Feeding ruminants a dietary protein and therefore N content close to their demand is an approach adopted for environmental and economic reasons. Due to efficient rumino-hepatic circulation of urea, ruminants are able to cope with a diminished N-intake. Ruminal microorganisms are able to synthesise microbial protein, which is the main protein source for ruminants by using non-protein N-compounds such as urea. In the case of a reduction in dietary N-intake, endogenously synthesised urea is less excreted by the kidneys, but secreted back to the rumen by the salivary glands and across the rumen epithelium. In previous studies, a dietary N-reduction led to diminished levels of blood calcium (Ca) through reduced intestinal Ca absorption which is mediated by a reduced expression of Ca‑transporting proteins due to decreased blood concentrations of 1,25-dihydroxy vitamin D3 (calcitriol), as the expression of intestinal Ca-transporting proteins is modulated in a calcitriol-dependent manner. The reason for diminished calcitriol levels might be a reduction in insulin like growth factor 1 (IGF1) concentration because IGF1 has a direct stimulating effect on renal calcitriol synthesis. IGF1 is mainly synthesised by the liver after pulsatile stimulation by growth hormone (GH) from the pituitary gland. The GH binds to the hepatic GH receptor (GHR) dimer and therefore initiates the Janus kinase-signal transducers and activators of transcription (JAK-STAT) pathway leading to IGF-1 secretion. The JAK-STAT signalling pathway is controlled via negative feedback by suppressors of cytokine signalling (SOCS) proteins. Thus, it has to be assumed that IGF1 is the link between reduced dietary N intake and diminished levels of calcitriol leading to a decrease in blood Ca levels. In the first part of the current PhD study, the effects of an N- and / or Ca-reduced feeding on renal Ca- and phosphate (Pi)-transporting proteins was investigated, as it was assumed that renal Ca-transporting proteins were modulated by these dietary interventions. It was shown that the expression levels of renal Ca-transporting proteins were modulated by a dietary N‑reduction contributing to diminished levels of blood Ca. However, a single reduction in dietary Ca did not cause a modulation of the examined renal proteins. Moreover, a singular reduction in dietary Ca led to an enhancement of renal calcitriol synthesis. The protein expression of renal Ca channel transient receptor potential cation channel subfamily V member 5 decreased due to the N-reduced feeding, whereas in the animals receiving the Ca reduced diet, the expression remained unchanged. The mRNA and protein expression levels of the Ca-binding protein, calbindin-D28K (CaBPD28K), and the sodium-Ca exchanger 1 (NCX1) were diminished in the N-reduced fed goats. By contrast, dietary Ca restriction increased the mRNA expression levels of CaBPD28K and NCX1. The mRNA and protein expression of the parathyroid hormone receptor decreased in response to the N-reduced feeding. The expression of renal sodium dependent Pi transporter type IIa was enhanced in the goats receiving the N-reduced diet, indicating a compensatory mechanism and leading to stable Pi levels, while the concomitant N and Ca reduction even led to increased plasma Pi levels. In the second part of the current PhD project, the impact of a protein-reduced diet on hepatic vitamin D and cholesterol metabolism was investigated and the examination of the somatotropic axis in relation to a potential modulation by dietary protein was performed. It was shown that a restriction in dietary protein has an impact on hepatic enzymes involved in vitamin D and cholesterol metabolism. Moreover, it was assumed that the influence of a low protein diet on the GH-IGF1 axis might be causal for reduced levels of blood Ca occurring during this feeding regime. Besides measuring GH concentrations over 24 h, components involved in GH signalling, leading to decreased hepatic IGF1 secretion, were considered in relation to the reduced protein feeding. The results show that the GH concentration patterns over 24 h were not modulated by the dietary intervention, while the expression levels of hepatic GHR were diminished due to the reduced dietary protein intake. Moreover, concentrations of blood Ca, calcitriol and insulin were reduced. The mRNA expression of JAK2 and STAT5B and protein expression levels of JAK2 and STAT1 were not modulated by the dietary intervention. Protein expression levels of STAT3 and STAT5B showed an upward trend due to the protein-reduced feeding. Expression levels of SOCS1 mRNA remained unaltered due to the protein-reduced feeding, while SOCS2 and SOCS3 mRNA and protein expression increased. Hence, it can be concluded that protein-reduced feeding leads to a disruption of the somatotropic axis that is mediated by a modulation of GHR expression. It was assumed that the reduction in GHR expression was mediated by diminished concentrations of insulin that occurred during the protein-reduced feeding as insulin is involved in GHR expression. Moreover, insulin release in turn is dependent on Ca. Thus, it can be concluded that decreased levels of blood Ca might be causal for the decrease in insulin concentrations. The results of this PhD project underline a limitation of the adaptive capacity of young goats to a low protein diet. Further investigations are needed to determine a potential modulation of the regulatory mechanism responsible for GH secretion by a reduced protein intake, as diminished IGF1 concentrations might affect GH secretion via feedback mechanisms. It would be of interest to determine whether the concentrations of IGF1 decreased due to a protein-reduced diet in general or whether concentrations of free IGF1 might remain unaltered. Moreover, further studies could examine the impact of reduced insulin levels as well as the modulation of calcitriol synthesis through other pathways with regard to their response to diminished protein intake.

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Firmenich, Caroline: Effects of dietary nitrogen and / or calcium on renal calcium and phosphate transport and modulation of calcitriol- and IGF1-synthesis in young goats. Hannover 2019. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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