Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung einer Th17-vermittelten Immunantwort bei der kaninen idiopathischen Epilepsie

Knebel, Anna

Bei der idiopathischen Epilepsie (IE), einer chronischen Erkrankung des Großhirns, bei der es zu rezidivierend auftretenden epileptischen Anfällen kommt, handelt es sich bis heute um eine Ausschlussdiagnose. In betroffenen Hunden kann trotz ausführlichen Untersuchungen (IVETF TIER-Level I-III) in der Klinik keine Ursache für die Anfälle gefunden werden. Die Therapie der IE ist notwendig, um die epileptischen Anfälle zu reduzieren und Notfallsituationen, wie Serienanfälle und einen Status epilepticus zu verhindern. Hierfür werden anti-epileptische Medikamente (anti-epileptic drugs, AEDs) eingesetzt. Die Therapie ist bisher nur symptomatisch, nicht heilend und führt nicht bei allen Patienten zu einer Verbesserung. Th17-Zellen, die zu den T-Helferzellen des erworbenen Immunsystems gehören, und ihr hauptsächlich synthetisiertes Interleukin-17 (IL-17), welches proinflammatorische Eigenschaften besitzt, werden im Zusammenhang mit der Entwicklung chronischer Entzündungen und schweren Autoimmunerkrankungen gesehen. Bei der Epilepsie des Menschen wurden Zusammenhänge zwischen IL-17-Werten und der Anfallsfrequenz und der Anfallsschwere gesehen. Besonders der Therapieerfolg einzelner Patienten mit therapieresistenter Epilepsie auf entzündungshemmende Medikamente AEDs zeigt, dass Entzündungsprozesse und Autoimmunerkrankungen für epileptischen Anfälle ursächlich sein können. In der Veterinärmedizin konnte gezeigt werden, dass die Messung der Th17-Zellen mittels Durchflusszytometrie im Blut von Hunden möglich ist und dass sie ebenfalls beim Hund im Zusammenhang zu chronischen Erkrankungen stehen können. Im Zuge von Untersuchungen von IL-17-bildenden Zellen in Hunden mit steril-eitriger Meningitis-Arteritis (SRMA) wurden diese in Hunden mit IE, die Teil der Kontrollgruppe waren, ebenfalls nachgewiesen. In vorliegender Folgeuntersuchung sollten Th17-Zellen mittels Durchflusszytometrie im Blut von Hunden mit IE und IL-17 in CSF- und Serumproben mittels ELISA von Hunden mit IE gemessen werden, um an die bisherigen Erkenntnisse anzuschließen und das Wissen über die Rolle der Th17-Zellen bei Hunden mit IE zu erweitern. Es sollte die Hypothese bestätigt werden, dass in Einzelfällen von Hunden mit IE ein autoimmuner Th17-vermittelter Pathomechanismus an der Generierung epileptischer Anfälle beteiligt ist. Die Ergebnisse von 57 Patienten wurden anschließend mit denen von zehn gesunden Beagles (Kontrollgruppe) verglichen und auf Zusammenhänge zu Parametern, wie der Anfallsfrequenz/Monat, dem Mittelwert der Anfallsfrequenz/6Monate, Anfallstyp, Anfallsschwere, Therapieerfolg, Anzahl der verabreichten AEDs, Abstand des letzten epileptischen Anfalls zur Blutentnahme beziehungsweise der MRT- und CSF-Untersuchung, Dauer der Erkrankung und Alter bei Auftreten des ersten Anfalls (Altersgruppe) untersucht. Th17-Zellen wurden außerdem stichprobenartig in Hunden mit IE kontrolliert. Auf Basis unseres modifizierten Protokolls wurden PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) aus dem Blut von Hunden mit IE isoliert, CD4+ Zellen mittels autoMACS Pro Separator angereichert, sowie mittels Ionomycin und PMA stimuliert und CD3+CD4+ Zellen intrazellulär mittels eines IL-17A-Biotin Antikörpers gefärbt und Th17-Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert und quantifiziert. In der Gruppe der Hunde mit IE waren deutliche „Ausreißer“ (17,54%) mit erhöhten Werten an stimulierten Th17-Zellen/µl (>100) erkennbar. Es könnte sich bei diesen Einzeltieren der Hunde mit IE um Hunde mit einer autoimmun-bedingten Enzephalitis (strukturelle Epilepsie) handeln. Es zeigte sich eine positive Korrelation zwischen den stimulierten Th17-Zellen der Hunde mit IE und der Anfallsschwere, wobei 40% der Hunde mit erhöhten Werten an Th17-Zellen/µl (>100) gegenüber 9% der Hunde mit nicht erhöhten Werten der Th17-Zellen/µl (<100) beide Notfallsituation, also Serienanfälle und einen Status epilepticus, erleiden mussten. Es konnte keine signifikante Veränderung der Th17-Zellen in Hunden mit IE über die Zeit oder im Zusammenhang mit dem Therapieerfolg beobachtet werden. IL-17-Werte in CSF- und Serumproben der Hunde mit IE waren im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht, wobei keine Korrelation zwischen den IL-17-Werten und dem Zeitpunkt der CSF-Punktion seit dem letzten Anfall vorlag. Es stellte sich eine negative Korrelation zwischen IL-17-Werten im CSF und der Anzahl der AEDs heraus. Hunde, denen aufgrund von epileptischen Anfällen im Zuge der diagnostischen Abklärung CSF entnommen und untersucht wurde, zu diesem Zeitpunkt jedoch noch nicht therapiert wurden, hatten dementsprechend höhere IL-17-Werte im CSF. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass in Einzelfällen von Hunden mit IE und schweren Anfallsformen erhöhte Th17-Zellen im Blut der Hunde messbar sind und ursächlich für die Anfallsgenerierung sein können. Anti-inflammatorische Medikamente könnten in diesen Einzelfällen von Hunden mit IE indiziert sein.

Idiopathic epilepsy (IE), a chronic forebrain disease characterized by the occurrence of recurrent seizures, is a diagnosis of exclusion. Despite of elaborate examinations (IVETF TIER- Level I-III) no cause for seizures can be found in a clinical setting in IE. Treatment of IE is essential to reduce seizure frequency and severity and to prevent emergency situations such as cluster seizures and status epilepticus. For treatment mainly anti-epileptic drugs (AEDs) are used, but these medications do not lead to an improvement in all patients. Th17 cells belonging to the group of T-helper cells of the acquired immune system and their synthesized interleukin-17 (IL-17), which has proinflammatory properties, seem to be associated with the development of chronic inflammatory diseases and severe autoimmune diseases. In human epilepsy associations between IL-17 levels and seizure frequency as well as seizure severity were noted. In particular, better therapeutic outcome of individual patients with refractory epilepsy after application of anti-inflammatory drugs was seen. In veterinary medicine, the measurement of Th17 cells in blood of dogs by flow cytometry is feasible. During studies of IL-17-producing cells in dogs with steroid-responsive meningitis-arteriitis (SRMA), IL-17-producing cells were also detected in dogs with IE. Accordingly, in the present study, Th17 cells were investigated by flow cytometry in blood of dogs with IE and IL-17 in CSF and serum samples using an ELISA to further expand the knowledge of the role of Th17 cells in dogs with IE. The results of 57 patients were compared with those of ten healthy beagles (control group) and correlated to parameters such as seizure frequency, seizure days/month, mean seizure days/6months, seizure type, seizure severity, response to treatment, amount of AEDs, time period from last seizure day to blood/CSF sampling, duration of disease and age at seizure onset (age group). Th17 cells were also randomly controlled in dogs with IE in a follow up study. Using a modified protocol, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from blood of dogs with IE, CD4+ cells were enriched with autoMACS Pro Separator as well as stimulated with ionomycin and PMA and CD3+CD4+ were stained intracellularly with an IL-17A-biotin antibody. Th17 cells were analyzed by flow cytometry and quantified. In the group of dogs with IE, outliers (17.54%) were observed displaying markedly elevated values of stimulated Th17 cells/μl (> 100). In these individual cases of dogs with IE an autoimmune encephalitis (structural epilepsy) could be the cause for seizures. There was a positive correlation between stimulated Th17 cells of dogs with IE and seizure severity. 40% of dogs with elevated values of stimulated Th17 cells/μl (> 100) have experienced both emergency situations (cluster seizures plus status epilepticus) in comparison to 9% of dogs with non-elevated values of stimulated Th17 cells/μl (<100). There was no significant change in Th17 cells in dogs with IE over time or in relation to treatment response. IL-17 levels in CSF and serum samples of dogs with IE were significantly increased compared to the control group, without correlation of IL-17 values to time point of CSF or serum sampling. There was a negative correlation between IL-17 values in CSF samples and the amount of AEDs used to treat seizures. Dogs presented due to seizures and for CSF sampling for diagnostic purpose and without any AED medication had elevated IL-17 values. In the present study, it could be shown that in some dogs with IE and severe seizures, increased Th17 cell levels were detected in blood and might be causative for the generation of seizures. Anti-inflammatory drugs could be indicated in these individual cases of dogs with IE and elevated Th17 cell numbers.

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Knebel, Anna: Untersuchung einer Th17-vermittelten Immunantwort bei der kaninen idiopathischen Epilepsie. Hannover 2019. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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